植物乳桿菌BLPC002產苯乳酸發酵培養基的優化

黃國昌，金丹鳳，邱小忠，熊大維

（江西省科學院微生物研究所，江西南昌 330096）

隨著人們對新型天然生物保鮮劑需求的增加，苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）因其具有寬廣的抑菌譜，能抑制多種食源性致病菌（包括引起食品腐敗的大部分細菌和真菌），且其溶解性好、對酸堿和熱穩定性強，成為了人們研究的熱點[1-5]。此外，苯乳酸近年還被發現作為新型生物相容性的單體，用于工業和醫藥領域合成重要的藥物[6-7]。然而目前苯乳酸發酵水平明顯不能滿足市場的需求，通過菌種改造、培養基優化、工藝優化等手段來提高產量是苯乳酸發酵研究的重點。

自1998年DIEULEVEUX V等[8-9]確定苯乳酸是白地霉（Geotrichum candidum）產生的主要抑菌物質以來，人們在苯乳酸發酵產量的提高方面做了大量的研究。楊小院等[10-11]研究發現，微膠囊化細胞和添加外源4,5-二羥基-2,3-戊二酮可增加自誘導子AI-2的表達及提高群體感應（quorum sensing，QS）能力，有利于提高苯乳酸的產量，并通過對發酵條件優化提高苯乳酸的產量。李興峰等[12-13]利用泡菜中篩選得到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SK007，并優化了補料發酵、靜息細胞和滲透化細胞轉化等工藝。李芬等[14-15]通過對植物乳桿菌LY-78進行誘變、培養基和發酵條件優化來提高苯乳酸產量。ZHENGZ J等[16]將篩選得到嗜熱苯乳酸生產菌Bacillus coagulansSDM，在50 ℃條件下利用全細胞轉化合成苯丙氨酸。另有一些學者通過構建重組基因工程菌的方法來提高苯乳酸的生產能力，ZHU Y B等[17]利用一些小的疏水基團替代戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）中D-乳酸脫氫酶（D-lactate dehydrogenase，D-LDH）的Tyr52基團，并通過全細胞催化在Escherichia coliBL21中過表達來提高苯乳酸的產量。

本研究從不同的環境中采用改良的菌種篩選方法分離得到2株苯乳酸高產菌株[18]，為進一步提高苯乳酸發酵產量，采用響應面法[19]（response surface method，RSM）對植物乳桿菌（L.plantarum）BLPC002發酵培養基進行優化，旨在為后續苯乳酸發酵放大試驗提供思路和基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002：本實驗室篩選保藏。

1.1.2 試劑

培養基各組分：生工生物工程（上海）股份有限公司；苯乳酸、苯丙氨酸標準品（純度98%）：美國SIGMA公司；甲醇、三氟乙酸（均為色譜純）：德國MERCK公司。

1.1.3 培養基

保藏培養基（MRS瓊脂培養基）：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，瓊脂20.0 g/L，蒸餾水1.0 L，pH6.2，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：苯丙氨酸4.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉5.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·7H2O 0.25 g/L，吐溫80 1.0 g/L，蒸餾水1.0 L，pH6.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

e2695 Alliance 高效液相色譜儀：美國Waters公司；SW-CJ-2FD雙人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；ZWY-2102C恒溫搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；NCMY40超純水機：重慶隆暾科技有限公司；Biostat A全自動發酵罐：德國賽多利斯集團。

1.3 方法

1.3.1 發酵液中苯乳酸的檢測方法

發酵液經10 000 r/min離心5 min和0.22 μm濾膜過濾后，采用Waters e2695 Alliance 高效液相色譜分離單元和Waters 2489 UV/Vis檢測器進行分析。參考黃國昌等[20]的方法，色譜柱：Waters Symmetry? C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30 ℃，進樣量：10.0 μL，流速：1.0 mL/min，流動相：A相為0.05%三氟乙酸甲醇溶液（V/V），B相為0.05%三氟乙酸溶液（V/V），洗脫程序：0～20 min為A∶B由10%線性變化為100%，20～23 min為100%A相，23～25 min保持A∶B為10%，檢測波長：210 nm。

1.3.2 培養方法

種子培養：取斜面保藏菌種1環接入滅菌后的MRS培養基中，裝液量為200 mL/500 mL，30 ℃、100 r/min搖床培養24h，備用。

發酵培養：以3%的接種量吸取種子液接入滅菌后的發酵培養基中，搖瓶裝液量為30 mL/100 mL，30 ℃、100 r/min搖床厭氧培養48 h。

1.3.3 單因素試驗

（1）氮源優化單因素試驗：以改良MRS培養基為基礎，在添加苯丙氨酸的情況下，每組試驗分別缺少一種氮源，進行單因素試驗，考察牛肉浸粉、蛋白胨、酵母浸粉對苯乳酸產量的影響。另外，在其他組成不變的情況下，考察了作為底物的苯丙氨酸、牛肉浸粉及酵母浸粉添加量對苯乳酸產量的影響。

（2）碳源優化單因素試驗：分別以20.0 g/L添加量的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和麥芽糖為唯一碳源，加入改良MRS培養基其他成分及苯丙氨酸，考察不同碳源對苯乳酸產量的影響。另外，在其他組成不變的情況下，單獨考察了最佳碳源添加量對苯乳酸產量的影響。

（3）其他因子單因素試驗：以MRS培養基為基礎，在添加苯丙氨酸的情況下，分別缺少磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鎂、醋酸鈉和吐溫80中的一種因子進行單因素試驗，考察各因子對苯乳酸產量的影響。

1.3.4 Plackett-Burman試驗

在單因素試驗的基礎上，利用Design Expert 8.0.7軟件選擇Plackett-Burman（PB）試驗設計從苯丙氨酸、牛肉浸粉、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸錳、吐溫80中篩選出對苯乳酸產量影響顯著的因素。每個因素選取高低2個水平，高水平約為低水平值的1.5倍，每組3個平行試驗，培養48 h后檢測發酵液中苯乳酸含量（Y）。PB試驗因素及水平見表1。

表1 發酵培養基配方優化Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design for fermentation medium formula optimization

1.3.5 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗結果，對影響顯著的因素設定合適的步長和變化方向，正效應因素水平增加，負效應因素水平降低，使影響顯著因素水平快速經濟逼近最佳區域，為下一步響應面優化試驗確定中心點。

1.3.6 Box-Behnken響應面優化試驗

以最陡爬坡試驗苯乳酸產量最高組對應的顯著影響因素水平為中心點，采用Box-Behnken（BB）試驗設計方法，以苯乳酸產量（Y）為響應指標，進行3水平試驗，確定各影響因素的最佳水平，得到最優培養基組成。BB試驗因素水平及其編碼見表2。

表2 發酵培養基配方優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation medium formula optimization

1.3.7 統計分析

運用Design Expect 8.0.7軟件對回歸模型進行方差分析和可靠性分析，并對最大響應值及各因素的最佳編碼值進行預測和驗證試驗，得出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002產苯乳酸的最佳培養組成。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同氮源對苯乳酸產量的影響

以改良MRS培養基為基礎，添加4.0 g/L苯丙氨酸，每組試驗分別缺少一種氮源，并以改良MRS培養基+4.0 g/L苯丙氨酸作為對照，每組試驗重復3次，配比及試驗結果見表3。由表3可知，缺少蛋白胨的試驗組與對照組苯乳酸產量幾乎相同；在不添加牛肉浸粉的情況下，苯乳酸產量有所提高；而缺少酵母浸粉時的苯乳酸產量最低，由此初步判斷，蛋白胨對苯乳酸的代謝過程無明顯影響，而牛肉浸粉和酵母浸粉對苯乳酸產量均存在影響，作為下一步篩選苯乳酸產量主要影響的因素。

表3 不同氮源對苯乳酸產量的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on the yield of phenyllactic acid

進一步對牛肉浸粉、酵母浸粉和苯丙氨酸添加量對苯乳酸產量的影響進行了研究，結果見圖1。由圖1可知，當牛肉浸粉添加量為3.0 g/L時，苯乳酸產量最高，隨著牛肉浸粉添加量增加，苯乳酸產量出現下降趨勢；隨著酵母浸粉添加量逐漸增加，苯乳酸產量有所增加，當酵母浸粉添加量達到3.0 g/L以上時，苯乳酸產量無明顯變化；苯丙氨酸添加量＜4.0 g/L時，苯乳酸產量呈增加趨勢，在4.0～5.0 g/L時，呈緩慢增加，隨后呈緩慢下降趨勢。進行Plackett-Burman試驗時，選擇牛肉浸粉3.0 g/L為低水平，選擇酵母浸粉3.0 g/L為高水平，選擇苯丙氨酸4.0 g/L為低水平。

圖1 不同氮源添加量對苯乳酸產量的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources addition on the yield of phenyllactic acid

2.1.2 不同碳源對苯乳酸產量的影響

不同碳源及最適碳源添加量對苯乳酸產量的影響如圖2、圖3所示。由圖2可知，以葡萄糖為唯一碳源時，苯乳酸產量最高，約為其他碳源的2倍以上，因此選擇葡萄糖作為植物乳桿菌BLPC002發酵苯乳酸的碳源。由圖3可知，當葡萄糖添加量＜20.0 g/L時，隨著葡萄糖的增加，苯乳酸產量增加明顯，當葡萄糖添加量＞20.0 g/L時，苯乳酸產量增長緩慢。故選擇葡萄糖添加量20.0 g/L為低水平進行Plackett-Burman試驗。

圖2 不同碳源對苯乳酸產量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the yield of phenyllactic acid

圖3 葡萄糖添加量對苯乳酸產量的影響Fig.3 Effect of glucose addition on the yield of phenyllactic acid

2.1.3 其他因子對苯乳酸產量的影響

考察了磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、酸酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂和吐溫80對苯乳酸產量的影響，以改良MRS培養基為基礎，添加4.0 g/L苯丙氨酸，每組試驗分別缺少其中一個因素，并以改良MRS培養基+4.0 g/L苯丙氨酸作為對照，每組試驗做3個平行試驗，結果取平均值，試驗方案及結果如表3所示。由表3可知，檸檬酸氫二銨、醋酸鈉和硫酸鎂對苯乳酸的產量沒有明顯的影響，且與對照組接近，而磷酸氫二鉀、硫酸錳和吐溫80對苯乳酸的產量產生了較明顯的影響，因此將磷酸氫二鉀、硫酸錳和吐溫80作為下一步篩選影響苯乳酸產量的因子。

表4 其他因子對苯乳酸產量的影響Table 4 Effect of other factors on the yield of phenyllactic acid

磷酸氫二鉀、硫酸錳和吐溫80的添加量對苯乳酸產量的影響見圖4。由圖4可知，磷酸氫二鉀添加量2.0 g/L時苯乳酸產量最高，硫酸錳添加量0.2～0.3 g/L時苯乳酸產量接近最大，吐溫80添加量1.0～1.5 mL/L時苯乳酸產量最高，故選擇添加量分別為磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸錳0.25 g/L、吐溫80 1.5 mL/L為高水平進行Plackett-Burman試驗。

圖4 磷酸氫二鉀、硫酸錳、吐溫80添加量對苯乳酸產量的影響Fig.4 Effect of K2HPO4,MnSO2 and tween 80 addition on the yield of phenyllactic acid

2.2 苯乳酸產量顯著影響因子的篩選

Plackett-Burman試驗結果見表5。利用DesignExpert 8.0.7軟件對表3的試驗結果進行回歸性分析，得到各因素的偏回歸系數和影響顯著性見表6。由表5、表6可知，苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖添加量對苯乳酸產量影響顯著，其中苯丙氨酸和葡萄糖為正效應，牛肉浸粉為負效應，作為下一步進行爬坡試驗的依據。

表5 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 5 Design and results of Plackett-Burman experiments

表6 Plackett-Burman試驗設計影響因素顯著性及效應分析Table 6 Significance and effect analysis of influence factors in Plackett-Burman experimental design

2.3 最陡爬坡試驗結果

表7 最陡爬坡試驗設計及結果Table 7 Design and results of the steepest ascent experiments

根據Plackett-Burman試驗分析的結果，選取苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖3個因素進行最陡爬坡試驗，苯丙氨酸和葡萄糖為正方向，爬坡起點分別為6.0 g/L和20 g/L，步長分別為1.0 g/L和5.0 g/L，牛肉浸粉為負方向，爬坡起點為3.0 g/L，步長為0.5 g/L。其他因子根據影響貢獻率大小，分別選取高低水平。試驗設計及結果見表7。由表7可知，隨著苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖添加量的變化，苯乳酸產量先升后降，當三者添加量分別為8.0 g/L、2.0 g/L和30.0 g/L時，苯乳酸產量最高，達到1.322 g/L，以此添加量作為中心點，進行下一步優化試驗。

2.4 Box-Behnken試驗設計及培養基組成優化結果

以最陡爬坡試驗結果為依據，進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設計，試驗結果如表8所示。試驗數據用Design Expect 8.0.7軟件進行回歸分析后，擬合得到以下回歸方程：

表8 Box-Behnken試驗設計及結果Table 8 Design and results of Box-Behnken experiments

運用Design Expect 8.0.7軟件對回歸模型進行方差分析，結果見表9。由表9可知，A、B、AB、BC、A2、B2和C2項的P值都小于0.05，其對結果有極顯著或顯著影響，且模型F值為32.71、P值為0.000 6＜0.05，表明回歸模型是顯著的，失擬項F值為3.25，P值為0.244 1＞0.05，表明模型失擬項不顯著，因此，回歸模型是高度顯著的，各試驗因子對響應值的影響呈二次拋物面關系。該模型Mean（響應值）=1.567，即苯乳酸產量的均數為1.567 g/L，R2（相關性決定系數）=98.33%，即由苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖及其二次項所確立的模型能解釋苯乳酸產量變化的98.33%，R2Adj（校正相關性決定系數）=95.32%，表明該模型的預測值和實測值擬合良好，可以很好地解釋響應值的變化情況，回歸方程給該菌株發酵生產苯乳酸提供了一個合適的模型。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of the regression model

根據回歸分析的結果，運用Design Expert 8軟件作出模型的響應曲面圖和等高線圖，如圖5所示，三維響應曲面圖和二維等高線圖是回歸方程的圖形解釋形式，可以直觀地顯示各因素之間的相互作用和最大響應值對應的各因素最佳水平，曲面越明顯表示響應值在試驗設計水平范圍內存在極值，變量對應的水平為等高線最小橢圓的中心點，等高線表示因素間的交互作用及影響的顯著性，等高線圖呈明顯的橢圓形表示因素間的交互作用明顯，等值線密度越大，表示該因素影響越顯著。

圖5 各因素交互作用對苯乳酸產量響應的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the yield of phenyllactic acid

2.5 最佳培養基成分的預測

通過對回歸方程各自變量求極值，得到回歸模型預測的最佳編碼值為A=0.147 5，B=-0.167 5，C=-0.0095，即苯丙氨酸8.295 g/L，牛肉浸粉1.832 5 g/L，葡萄糖29.952 5 g/L。此時，苯乳酸產量最大預測值為1.674 1 g/L?？紤]到實際操作需要，確定最佳培養基添加量分別為苯丙氨酸8.3 g/L，牛肉浸粉1.8 g/L，葡萄糖30.0 g/L。在此條件下苯乳酸產量為1.67 g/L。

2.6 驗證試驗

為驗證模型的可靠性和預測最大值，用上述最佳培養基配方進行5次平行驗證試驗，苯乳酸平均產量為1.67 g/L，與預測值非常接近，說明該模型能準確反映各因素的變化與PLA產量之間的關系，該模型的設計具有可靠性。

3 結論

通過對植物乳桿菌BLPC002發酵培養基優化后，苯乳酸產量達到1.67 g/L，比優化前的0.358 g/L提高了4.6倍；通過單因素試驗、響應面法試驗設計及回歸模型方差分析，篩選出了對苯乳酸產量具有顯著影響的3個因素，分別為苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖，確定了三者最佳添加量分別為8.3 g/L、1.8 g/L、30.0 g/L，苯乳酸產量為1.67 g/L，并通過驗證試驗，苯乳酸產量與預測值非常接近，表明該模型的設計具有可靠性。