影響附植期豬胚胎形態轉變相關基因研究進展

臧旭鵬，胡 群，吳珍芳，蔡更元，黃思秀，洪林君

（華南農業大學動物科學學院，國家生豬種業工程技術研究中心，廣東廣州 510642）

窩產仔數是養豬生產中最重要的經濟性狀之一，從排卵到受精、附植，胚胎生長過程中的每一步都會影響窩產仔數，而附植期對窩產仔數的影響最大。在排卵和受精過程完成后，豬胚胎產前死亡率在20%～46%[1]，胚胎發生死亡主要在胚胎附植期[2]。在胚胎附植期，妊娠第12 天是影響胚胎存活的關鍵時間點，中國太湖豬在其妊娠第12 天時胚胎具有良好的附植狀態，降低了胚胎最終死亡率[3]。胚胎死亡率越高，其窩產仔數越少。因此，研究調控附植期胚胎死亡的關鍵基因及其分子機制具有重要的理論和實踐意義。本文綜述了豬附植期胚胎發育過程及影響豬胚胎形態轉變關鍵基因，為進一步研究豬早期胚胎附植過程調控機制提供參考。

1 豬附植期胚胎發育過程

豬早期胚胎的正常發育和妊娠的成功建立伴隨著相關基因的表達，隨著胚胎的發育，不同的基因表現出不同的表達模式，包括周期性的表達等，該階段共涉及大約10 000 種基因表達模式[4]。在早期妊娠過程中，豬胚胎在附植到子宮表面（即子宮內膜腔上皮）前會經歷一個形態學過程上的轉變，這個轉變會使胚胎與母體建立相互聯系時有一個最大的接觸面積，這對于母體妊娠的識別和胚胎在附植前的正常發育至關重要，是豬胚胎成功附植、母體成功妊娠的必要前提條件[5]。此外胚胎與母體子宮接觸面積增大也促進了胚胎從子宮獲取更多的營養物質[2]。豬胚胎從成功受精形成合子后開始正常發育，大約在受精后的第60～72 小時即發育到桑葚胚階段，胚胎開始進入子宮。在妊娠的第5 天左右發育至囊胚階段，并在第8天左右開始孵化[6]。孵化后，豬胚胎繼續生長，在第10 天左右形成一個直徑為2～6 mm 的球形胚胎，隨后轉變成卵圓形并進一步轉變為管形胚胎[7]，在妊娠第11～12 天，管形胚胎在1～2 h 內迅速伸長轉變為細長的絲狀胚胎，長度為100～150 mm（圖1）[8]。胚胎的伸長涉及外胚層的分化和中胚層的生長，滋養外胚層接頭復合物的松動使得細胞可以相互移動，有利于內胚層細胞的遷移和重塑，進而促進絲狀胚胎的形成[9]。之后胚胎繼續發育，不過此時的胚胎不會再像第11～12 天時那樣迅速伸長，而是進入一個相對緩慢的伸長發育階段，直到第18 天左右胚胎與子宮上皮內膜相接觸，引發上皮絨毛膜胎盤的形成[10]。豬胚胎的快速伸長、形態學上發生劇烈轉變的階段，被稱之為胚胎的形態轉變期。由于豬胚胎從球形到絲狀胚胎的形態轉變主要靠滋養層細胞的遷移和重組，因此又被稱為豬胚胎滋養層的快速伸長期[11]。

2 調控豬胚胎形態轉變的關鍵基因

豬胚胎的成功附植受到一系列生物學過程的調控，包括豬胚胎發育及形態轉變，胚胎-母體相互作用以及母體妊娠識別[12-14]。其中，豬胚胎形態轉變是影響豬胚胎能否成功附植的關鍵，近年來，調控胚胎形態轉變的關鍵基因被陸續發現，如成纖維細胞生長因子4（Fibroblast Growth Factor 4，FGF4）、白細胞介素-1β亞型2（IL1B2）以及干擾素（IFNs）基因。

2.1FGF4基因 FGF4 是由外胚層（Epiblast）產生[15]的一個多能性生長因子，其化學成分是一個小的多肽，屬于肝素結合生長因子家族成員[16]，能夠誘發多種類型的組織和細胞完成不同的生物學功能，被證實能夠促進滋養層細胞的增殖[17]，在妊娠第12 天時表達量增加[18]。研究表明，胚胎的生長伴隨著旁分泌信號所引發的正反饋回路（Feed-Back Loop），該反饋回路可以促進細胞的特定分化[19]。FGF4 和骨形態發生蛋白4（Bone Morphogenesis Protein 4，BMP4）都是誘導型信號，參與正在發育的胚胎外胚層和胚外胚層（Extraembryonic Ectoderm，ExE）之間的信號交流[20]。FGF4 在滋養外胚層細胞上的受體成纖維細胞生長因子受體2（Fibroblast Growth Factor Receptor 2，FGRFR2）的激活是胚胎或子宮內膜通過磷脂酰肌醇3-激酶/AKT 通路來轉導FGF4信號完成的，AKT 信號通路中p-AKT、p-P90RSK、p-RPS6 蛋白的增加與滋養外胚層細胞的遷移活動相關聯，對胚胎發育至關重要[21]。外胚層產生的FGF4 與滋養外胚層上FGRFR2 的結合，會誘導絲裂原活化蛋白激酶（MAPK/ERK）的磷酸化來激活MAPK/ERK，這將觸發一個信號轉導通路反應，從而刺激CDX2 的表達，誘導中胚層細胞（Mesoderm）產生BMP4[22]。AKT 和MAPK 細胞信號通路的傳導，能夠調節脂聯素的表達[23]，涉及細胞增殖、細胞死亡、細胞黏附等過程來影響胚胎的附植[24]。CDX2 將和Eomes、ELF5 一起構成1 個基因調節網絡的一部分，能夠促進胚外胚層（ExE）滋養層細胞的發生[25]。CDX2 也將促進BMP4 的表達[26]，通過反饋回路，反饋回外胚層來誘導中胚層的分化[27]，由新生的中胚層細胞來產生BMP4，產生的BMP4 將激活CDX2 和ELF5，使得滋養外胚層細胞中SMAD1/5/8磷酸化增加，活化發揮作用[20]。敲除FGF4和FGFR2后，胚胎不會形成內胚層細胞系，同時該時期FGF4-FGFR2信號體系的表達，與胚胎附植期死亡率最高這一時間吻合，表明了FGF4-FGFR2 信號體系對胚胎發育的重要性[28-29]。

圖1 妊娠過程中豬胚胎發育模式圖

2.2IL1B2基因 促炎反應因子會作用于妊娠期間的胚胎和子宮內膜，是影響妊娠過程中胚胎附植失敗和死亡的一個主要因素[30]。而白細胞介素-1β（Interleukin-1β）參加機體促炎反應（Proinflammatory），是一個主要的促炎反應因子，在附植前期，由囊胚釋放，可以通過促進胚胎與子宮內膜的接觸和附植來促進妊娠的建立[31]。研究發現，豬胚胎快速伸長期間，滋養層IL1B表達量增加，即胚胎在形態學上從管形到絲狀階段的轉變過程中，IL1BmRNA 和蛋白質表達豐度明顯增加，出現了一個表達和分泌峰，但當滋養層快速伸長期結束時，IL1B表達量會出現一個瞬時的降低，較之前大約降低了2 000 倍[32]。IL1B基因在豬胚胎中表達量倍增是由于豬胚胎中表達了1 個IL1B的新亞型IL1B2。IL1B1與IL1B2對比發現，它們都有7 個外顯子，分布于第3號染色體上，但IL1B2中包含1 個可變外顯子能夠提供不同的轉錄調節。研究通過把IL1B分別從妊娠12 天的豬胚胎和周邊血液白血球（PBLs）的mRNA 中克隆分離出來，發現了只有在豬胚胎中才會表達這個新亞型（IL1B2）[33]。通過使用CRISPR/Cas9 技術敲除豬胚胎中的IL1B2基因，發現胚胎滋養層不會出現伸長，同時胚胎芳香酶的表達和雌激素分泌減少，表明了IL1B2可能涉及胚胎妊娠建立過程中所需雌激素在時空上的合成，同時，其能夠調節胚胎的伸長和與子宮表面相接觸時子宮內膜的促炎反應[34]。白細胞介素1（IL1）的信號系統很復雜，共含白細胞介素1 及其受體共22 種分子，包括促炎因子IL1B 和IL1A、功能性受體IL1RⅠ、誘餌受體IL1RⅡ、拮抗分子IL1RA 和IL1 受體輔助蛋白IL1RAP 等[35]。IL1RⅠ和IL1RAP Toll 樣受體的并置激活了1 個第二信使蛋白相互作用的級聯反應，此時附植前期豬胚胎表達的IL1B 新亞型（IL1B2）能夠激活子宮上皮表面的核因子κB（Nuclear Factor-kappa B，NFKB）。核因子κB 是一個轉錄因子，由保守亞基組成，能夠控制先天的和自適應的免疫反應[36]，這就如同在豬妊娠建立期間創造了一個促炎反應的微環境[33]，通過IL1B2 的激活，NFKB 可以進入細胞核，調節超過100種基因的表達[37]，這對哺乳動物妊娠的建立是必要的[38]。

2.3IFNs基因 在胚胎快速伸長期結束后，IL1B2基因的表達量迅速減少，在妊娠的第12～20 天，豬胚胎滋養外胚層分泌Ⅰ類型的干擾素-δ（IFND）和Ⅱ類型的干擾素-γ（IFNG），其在妊娠第14～16 天時會達到一個最大的分泌水平[5]，與球形胚胎相比，第14 天的絲狀胚胎中IFNG 的mRNA 表達量增加了567 倍[39]。與反芻動物胚胎產生的干擾素-τ（IFNT）不同，IFNT 會抑制子宮內膜產生PGF2α，作為反芻動物的妊娠識別信號[40]，其與豬妊娠過程中產生的雌激素的功能相一致，但豬胚胎產生的IFNs 并不表現出抑制黃體溶解的作用[41]。Ⅰ類型的IFNs，通過與它們的異質二聚體Ⅰ類型IFN 受體（包括IFNAR1 和IFNAR2）結合，轉導信號進入細胞[42]。IFNAR1 和IFNAR2 的mRNA 在子宮內膜中表達，妊娠第12 天時表達豐度最大，雌二醇（Estradiol）和IL1B 可以影響其在時空上的表達量[43]。IFND 通過和IFNAR2 亞基相互作用，與IFNAR1 鏈一起形成1 個三聚體復合物，從而引發細胞內的信號級聯反應[44]。由豬胚胎分泌的雌激素、IFND 和IFNG 可以同子宮腔和基質中激活的信號轉導子和轉錄激活因子1（Signal Transducer and Activator of Transcription 1，STAT1）一起誘導細胞通路，來完成滋養層的附植和對母體免疫應答的調節[45]?；|細胞中STAT1 的激活會誘導胚胎來表達IFNG，胚胎在附植期的死亡與IFNG 表達的缺失，使得其過早與雌激素接觸有關[46]。而IFNG 作為一個滋養層信號，可以誘導子宮內膜細胞來表達一些趨化因子，包括涉及子宮內膜與滋養層之間信號交流的CCL2、CCL5、CCL11、CXCL12 和涉及胚胎-母體之間免疫容受環境的CXCL9 和CXCL10 等[47]。

3 小結與展望

綜上所述，在早期妊娠過程中，豬胚胎為了成功完成與母體的識別和附植，其經歷了一個在形態學上從球形到絲狀的劇烈變化，以獲得足夠的表面積來與母體子宮內膜相接觸，進行妊娠信號的交換及營養物質的獲取。在胚胎形態轉變期，成纖維細胞生長因子4、白細胞介素-1β亞型2 和干擾素3 個關鍵基因影響胚胎的正常發育及胚胎形態的成功轉變，敲除這些基因將導致囊胚內胚層的不分化、滋養層不能伸長等，從而導致胚胎發育失敗而死亡。雖然目前國內外的學者對影響胚胎附植期形態轉變的相關基因有了一定研究，但對于具體的分子調控機制仍不清楚，只有較少的候選基因被鑒定出來，對該階段導致高胚胎死亡率的原因仍有待進一步了解。因此，深入研究豬胚胎附植階段基因的動態轉錄過程及其調控機制將是今后的研究重點，若能鑒定出顯著影響胚胎附植成功率的功能基因，可為高繁殖力豬種的培育提供育種基因素材。