秦川牛TNNC2 基因的表達規律研究

杜嘉偉 ，張薇依，李安奇，蘇曉彤，杜鑫澤，褚瑰燕，昝林森,2，王洪寶,2*

（1.西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.國家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100）

牛作為家畜飼養已有幾千年歷史[1]，與豬、雞相比，?？梢韵拇罅康那啻诛暳虾娃r副產品，是國家發展節糧型畜牧業的重要畜種。目前，地方黃牛仍然是我國牛肉生產的主要品種，這些品種普遍具有耐粗飼、抗逆性強、肉質細嫩等優點，但存在生長速度慢、胴體產肉少、優質牛肉切塊率低、脂肪沉積不理想等缺陷[2]。為增強我國肉牛產業的市場競爭力，育種工作者需充分有效地利用國內現有的黃牛資源優勢，通過現代分子育種技術提高肉牛生產性能和改善牛肉生產品質，加快對地方黃牛的改良步伐[3]。

骨骼肌是哺乳動物身體結構中的重要組成部分，參與機體的運動和能量代謝。骨骼肌收縮系統位于肌肉的細肌絲內，該系統主要包括鈣蛋白酶復合體（Tropinon，Tn）、纖維蛋白原（Tropomyosim，Tm）和肌動蛋白（Actin）。鈣蛋白酶復合體由肌鈣蛋白C（TnC）、肌鈣蛋白I（TnI）和肌鈣蛋白（TnT）3 種亞基組成[4]。研究發現，當人骨骼肌纖維和心臟小梁TnC 蛋白缺失時，肌纖維張力和最大收縮力明顯不同，表明TnC 蛋白在肌纖維收縮過程中起著相當重要的作用[5]，而骨骼肌的收縮會影響肌肉的嫩度、剪切力、熟肉率等[4]。TnC 包含TNNC1（Troponin C，Slow Skeletal Muscle）和TNNC2（Troponin C，Fast Skeletal Muscle）2 種蛋白。TNNC2 為骨骼肌快肌肌鈣蛋白，已有研究表明該基因與關節遠端畸形疾病的發生有著必要的聯系，另外該基因還參與心臟信號傳導及鈣信號傳導途徑[6]。TNNC2 可通過本身具有的Ca2+結合位點，與Ca2+結合后引起肌肉收縮并釋放能量和環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB），CREB 通過啟動核內的c-myc 和其他原癌基因單獨或協同調控肌蛋白的形成，從而開始肌纖維的生長分化[7]。肌鈣蛋白復合物位于橫紋肌細絲上，是調節肌肉收縮和松弛的鈣敏感開關，它由3 個亞基組成：肌鈣蛋白C（TnC），鈣結合亞基；肌鈣蛋白T（TnT），其主要功能是使復合物與原肌球蛋白結合；肌鈣蛋白I（TnI），則屬于抑制亞基[8]。目前對于TNNC2基因在農業動物上的研究較少，其在牛上的表達特性和可能功能尚未被闡明，因此本研究選取TNNC2基因為目標基因，以秦川牛為研究對象對其進行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育種實踐中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物采樣 本實驗樣本均來自西北農林科技大學國家肉牛改良中心的肉牛良種繁育場，將新生秦川牛（3 日齡）和成年秦川牛（24 月齡）各3 頭作為研究對象，屠宰后取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、瘤胃、網胃、瓣胃、皺胃、腎周脂肪、皮下脂肪、背最長肌等組織，液氮冷凍后轉存-80℃冰箱長期保存。新生牛背最長肌組織用于后續成肌細胞的分離培養。

1.1.2 實驗器材與儀器設備 10 cm 培養皿（NEST）、1.5 mL/200 μL 離心管（NEST）、PBS 緩沖液（Thermo Fisher）、酒精燈、槍頭（Eppendorf）、96孔板封口膜（Thermo Fisher）、Trizol （ThermoFisher）、異丙醇、胰蛋白酶、氯仿、DEPC 水（ThermoFisher）、反轉錄試劑盒（Takara）、實時熒光定量試劑盒（Takara）、上下游引物（西安擎科）、6 孔板（NEST）等。實時定量PCR 儀（ABI7500）、酶標儀（Tecan Austria GmbH 5082）、通風櫥、5811R離心機（Eppendorf）、5424R 離心機（Eppendorf）、制冰機、QL-901 旋渦震蕩儀、小型離心機、37℃恒溫培養箱以及2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL、5 000 μL 定量移液槍等。

1.2 實驗方法

1.2.1 秦川牛各組織總RNA 的提取和cDNA 的合成 采用傳統的Trizol 法提取各組織的總RNA。提取過程為：取少量組織樣于研缽中，加入液氮反復研磨；加入500 μL Trizol，繼續研磨混勻后轉移至1.5 mL 離心管中，室溫放置15 min 后4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；取上清，按Trizol 總體積1/5 的量加入氯仿，劇烈振蕩15 s 后室溫靜置5 min；4℃、12 000 r/min 離心15 min；取上清加入等體積的異丙醇充分混勻后室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；棄上清，加入1 mL 4℃預冷的75%乙醇，4℃、8 000 r/min離心5 min；室溫干燥2～5 min；用適量RNase-free 水溶解RNA，測定濃度后于-80℃保存備用。使用酶標儀（Tecan Austria GmbH 5082）檢測所提取總RNA 的純度及濃度，并使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。以提取的RNA 為模板，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa，code No.RR047Q）操作步驟進行cDNA 的合成。

1.2.2 秦川牛成肌細胞培養及cDNA 樣品準備 將秦川牛成肌細胞復蘇后采用生長培養基（含體積分數20%的牛血清和體積分數1%的雙抗的F-12/DMEM）培養，待細胞長至80%左右融合時使用分化培養基（含體積分數2%的馬血清和體積分數1%的雙抗的F-12/DMEM）培養，每2 d 更換1 次培養基，于分化第0、2、4、6、8 天取細胞樣品，采用Trizol 法提取RNA，并反轉錄為cDNA[9]。

1.2.3 實時熒光定量PCR 根據GenBank 已公布的牛TNNC2基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異實時熒光定量引物，送交西安擎科有限公司合成。以β-Actin 基因作為內參進行實時熒光定量PCR 反應。PCR 反應體系為20 μL：TB Rreen Ⅱ 7.5 μL（終濃度1X），cDNA 1.4 μL（終濃度100 ng/μL），上下游引物各0.3 μL（終濃度0.2 μmol/L），加RNase free H2O 補足體系。于Bio-Rad 熒光定量PCR 儀（CFX Connect）上進行反應，反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環；采集熔解曲線熒光信號和達到峰值循環數Ct 值。采用2-△△Ct法對數據進行分析，具體公式為：△Ct1=待測組目標基因Ctmean－待測組β-ActinCtmean；△Ct2=基測組目標基因Ctmean－基準組β-ActinCtmean；RQ=2-(△Ct1-△Ct2)=2-△△Ct，其中，Ctmean代表3 次重復的平均值，RQ（Relative Quantification）值代表實驗待測組目的基因的表達相對于基準組變化的倍數[10]。

1.3 統計分析TNNC2基因在不同組織中以及肌細胞不同分化時期的表達差異采用單因素方差分析進行計算，多重比較以表達量最低組織或誘導分化第0 天為對照，使用LSD 方法進行。TNNC2基因在新生牛與成年牛特定組織中的表達差異分析用t檢驗進行計算，P<0.05 表示差異顯著。

表1 實時定量PCR 引物序列

2 結果

2.1 成年牛不同組織TNNC2基因相對表達量的檢測本實驗中得到的TNNC2基因在成年牛不同組織中的表達量是以肝組織中TNNC2基因的相對表達量作為標準（單位1），計算獲得的各組織相對水平，研究結果如圖1 所示，TNNC2基因在各組織中廣泛表達，但表達量不盡相同。其中TNNC2基因在肝臟中表達量最低，在瘤胃、網胃、腎周脂、腎臟等組織中表達量依次增多，但在這些組織中的整體表達水平依舊較低。該基因在成年牛背最長肌中的表達量極顯著高于其他組織。

圖1 成年秦川牛TNNC2 基因在不同組織中的表達量

2.2 新生牛不同組織TNNC2基因相對表達量的檢測 本實驗得到的TNNC2基因在新生牛不同組織中表達量是以肺臟組織中TNNC2基因的相對表達量作為標準（單位1），計算獲得的各組織相對水平，結果如圖2 所示，TNNC2基因在新生牛肺臟組織中的相對表達量最低，在瘤胃、腎臟、小腸、網胃、大腸、瓣胃、脾臟、腎周脂、皺胃、心臟中的表達量依次增加，但整體處于低表達水平，而在后腿肌和背最長肌中的表達量遠遠高于其他組織。

圖2 新生秦川牛TNNC2 基因在不同組織中的表達量

2.3 成年牛與新生牛重要組織相對表達量的比較 如圖3 所示，TNNC2基因在成年秦川牛背最長肌、大腸、肺臟中的相對表達量極顯著高于新生秦川牛，在成年秦川牛皮下脂肪、網胃、瓣胃、腎臟、心臟、腎周脂等組織中的表達量顯著高于新生秦川牛，而在瘤胃和脾臟中表達差異不顯著。

圖3 成年牛與新生牛重要組織相對表達量的比較

2.4TNNC2基因在成肌細胞不同分化天數的表達規律的測定TNNC2基因在成肌細胞誘導分化不同天數的相對表達量是以第0 天作為標準得出的結論。由圖4 可知，從整體趨勢上來看，TNNC2基因在成肌細胞分化過程中的表達量是上升的，但在第6 天TNNC2基因的表達量稍有下降，該基因的表達趨勢與成肌細胞的分化程度相一致，由此推測TNNC2是與肌細胞分化相關的基因，后續研究可聚焦于其對于牛肌細胞增殖分化的影響。

圖4 TNNC2 基因在肌肉細胞不同天數的表達規律

3 討 論

目前，有關TNNC2基因功能的研究文獻很少，已有研究證實TNNC2基因不僅對肌肉發育有影響，同時還與一些疾病的發生相關。如TNNC2基因與人類的先天性肌病有關，當TNNC2基因發生顯性突變時將伴有聲帶麻痹及眼肌麻痹等臨床癥狀[11]。另外，在女性妊娠過程中，TNNC2基因突變將引起呼吸系統受損、羊水過少等臨床癥狀[12]。農業動物上的研究發現，TNNC2可以作為一個豬肉品質相關的候選基因[13]。綿羊上的研究表明，TNNC2基因不同基因型與綿羊肉的剪切力、大理石紋評分顯著相關，說明TNNC2 等位基因對綿羊肉嫩度有正向影響[14]。

本實驗主要采用qRT-PCR 技術檢測了TNNC2基因在新生秦川牛和成年秦川牛不同組織中的表達模式，同時檢測了該基因在成肌細胞誘導分化后不同天數的表達規律，研究結果初步揭示了TNNC2基因的表達特性及規律。無論在新生牛還是成年牛中，TNNC2在背最長肌中的表達量都極顯著高于其他組織，其在成年牛背最長肌中的表達量約為新生牛的3 倍，說明其對肌肉的生長發育可能具有重要的調控作用。除了肌肉組織（骨骼肌和心?。?，TNNC2在新生牛其他組織中的表達水平都很低，進一步證實了該基因與肌肉發育可能存在密切關系。隨著秦川牛的生長發育，TNNC2基因在各個組織中的表達量均有所提高，但整體表達水平依然不高，推測其可能原因是內臟組織（如脾、腎等）均為非肌肉組織，TNNC2不參與其行使功能。有意思的是，TNNC2基因在成年牛肺臟中的表達水平極顯著高于新生牛，提示該基因可能與牛的呼吸功能有關，這與Donkervoort 等研究結果一致[12]。TNNC2基因在新生牛和成年牛大腸中的表達量差異極顯著，可能的原因還需進一步研究。

本研究得到了TNNC2基因在成肌細胞分化不同天數的表達規律：從總趨勢上來看，雖然在分化至第6 天時TNNC2基因的表達量稍有下降，但TNNC2在成肌細胞分化過程中的表達量整體呈上升趨勢，提示該基因可能促進肌細胞的分化，可嘗試在肌細胞中對該基因進行過表達或干擾，進一步闡明其對牛肌細胞增殖和分化的影響。

4 結 論

本研究發現，TNNC2基因在秦川?？旒〗M織（如背最長肌、后腿肌等）中的表達水平顯著高于其他組織，同時隨著牛成肌細胞的不斷分化，該基因的表達水平逐漸升高，推測TNNC2基因對秦川牛骨骼肌的生長發育具有重要的調控作用，可將其作為影響肉牛生長和肉質性狀的候選基因加以深入研究。