混合無機氮源下6株微藻對亞硝態氮、氨氮凈化規律初探

茍萬里，李自英，武心華，文雙喜，楊 智

( 1.貴陽學院 環境與生物工程學院，貴州 貴陽 550005； 2.青島蔚藍生物集團股份有限公司，山東 青島 266000 )

近些年來，集約化水產養殖發展迅速，其高密度、高投餌的養殖方式在水體中累積了大量含氮排泄物和殘餌[1]，導致養殖水體的富營養化程度嚴重，尤其是養殖中后期，水體中的氨氮、亞硝態氮、硝態氮含量普遍偏高甚至超標[2]，給養殖動物帶來潛在危害[3-4]。據研究，亞硝態氮作用于水生動物體內的血紅蛋白或銅藍蛋白、溶氧酶和抗氧化酶，影響水產動物的血液載氧功能和免疫功能，水產動物長期處于亞硝態氮超標的水體會出現“游塘”、“浮頭”、“偷死”、“冒底”等現象[5]。氨氮在高pH時以分子氨為主，分子氨影響魚類正常生理活動，易造成暴發性出血病的流行[6]；影響蝦類生長和變態，破壞血細胞的超微結構，使鰓上皮細胞溶解、角質層受損，鰓腔內出現空泡化現象等[7]。因此，如何控制池塘水體中的亞硝態氮和氨氮含量使之處于安全范圍之內是高密度水產養殖生態環境管理上的重要問題[8-9]。

微藻是池塘養殖中必不可少的低等植物，是水體的初級生產者和優質生物餌料，也能吸收利用各種形式的無機氮而起到凈化水體的作用[10]。研究表明，當以氨氮、亞硝態氮或硝態氮為唯一氮源時，各類微藻對相應的無機氮均具有良好的凈化能力[11-13]。當培養體系中同時存在氨氮和硝態氮時，大多數微藻尤其是藍綠藻優先凈化氨氮[14-15]；在總氮充足的條件下，水體中超過1 μmol/L的氨氮會抑制微藻對硝態氮的凈化，且其抑制程度受藻種、光照度、總氮量等因素的影響[16-18]。當水體中同時存在硝態氮和亞硝態氮時，通常認為硝態氮會抑制亞硝態氮的凈化[19]。當水體中同時存在氨氮、硝態氮、亞硝態氮時，有關微藻對這3類氮源凈化規律的報道不多，目前僅見以養殖魚、蝦的水為培養基的報道[20-22]，這種培養基除了含有上述3種無機氮外，還含有一定量的有機氮。目前，尚未見關于微藻在僅以氨氮、硝態氮、亞硝態氮為氮源的水體中生長時對這3種無機氮的凈化規律的研究報道。

為進一步研究微藻對3種無機氮源的凈化規律，同時考慮到氨氮和亞硝態氮在水產養殖水體中的潛在危害，筆者在實驗室條件下，以添加了少量氨氮和亞硝態氮且不含有機氮源的改良F/2培養基培養水產養殖中常見的6種餌料微藻，分析不同微藻培養液中亞硝態氮和氨氮含量的變化趨勢，研究微藻在混合無機氮源下凈化氨氮和亞硝態氮的優先順序，以期為利用微藻控制水體亞硝態氮和氨氮含量提供參考依據，同時篩選出能快速凈化亞硝態氮和氨氮的候選藻種。

1 材料與方法

1.1 藻種及其培養基

試驗所用的柵藻(Scenedesmussp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)、塔胞藻(Pyramimonassp.)由中國海洋大學藻種庫引進，在本試驗中的編號依次為KDN7、KDN13、KDN18、KDN20、KDN21。一株由筆者分離的硅藻，根據形態初步鑒定為雙眉藻屬(Amphorasp.)，其編號為KDN17，顯微鏡下的形態見圖1。

圖1 雙眉藻KDN17的顯微照片(×400)

以F/2培養基[23]擴繁各株綠藻，以添加了50 mg/L NaSiO3·9H2O(分析純)的F/2培養基擴繁各株硅藻。其他試驗所用培養基均去掉擴繁用培養基中的維生素，其余成分保持不變，同時添加一定量分析純級的硫酸銨、亞硝酸鈉以提供氨氮和亞硝態氮。所用水均為蒸餾水。

1.2 藻類的擴繁

將上述各藻種的儲備培養物轉接在新鮮無菌的培養基中，于溫度25 ℃、光照度12 000 lx、光照周期14 L∶10 D、早晚各搖瓶1次的條件下培養4～5 d，經檢查達到對數生長期后，再轉接到新鮮的培養基中，如此反復轉接培養2～3次，用生長旺盛并處于對數期的藻液做后續試驗。

1.3 混合氮源下微藻的生長及其對氨氮、亞硝態氮的凈化

以擴增繁殖用的培養基為基礎，向其中加入一定量的(NH4)2SO4和NaNO2，使培養基中的氨氮質量濃度為2.0 mg/L，亞硝態氮質量濃度為1.0 mg/L。取1.2中擴增繁殖至對數期的新鮮藻液30 mL于8000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，用新配制的培養基懸浮沉淀，于同樣條件下離心，再用30 mL新配制的培養基懸浮沉淀，取懸浮藻液接種入新鮮培養基中。每個藻株做3個平行，每個平行的培養體積為3000 mL，盛于滅菌過的5000 mL帶塞錐形瓶中，接種后立即取藻液20 mL，檢測初始氨氮、亞硝態氮質量濃度及初始藻細胞密度，之后每日于光照結束時搖勻后取適量藻液(第1～2 d取50 mL藻液，第3～6 d取100 mL藻液)，檢測其中的氨氮、亞硝態氮質量濃度和藻細胞密度，按下式計算相關數據：

1.4 相關指標的檢測方法

氨氮的檢測采用靛酚藍比色法[24]；亞硝態氮含量的檢測采用鹽酸萘乙二胺比色法[25]；藻細胞密度采用血球計數板顯微直接計數法[26]。

1.5 各指標變化趨勢圖繪制

采用Origin 8.5繪圖，以培養時間為橫坐標，以藻細胞密度、氨氮質量濃度、亞硝態氮質量濃度為縱坐標，獲得各株微藻的生長曲線以及在培養過程中各藻株培養液中氨氮質量濃度和亞硝態氮質量濃度的變化趨勢圖。以培養時間為橫坐標，以每日的氨氮相對凈化率、亞硝態氮相對凈化率為橫坐標獲得各藻株對氨氮、亞硝態氮凈化情況的柱形圖。

2 結果與分析

2.1 混合無機氮源下各株藻的生長情況及其培養液中氨氮、亞硝態氮質量濃度變化趨勢

2.1.1 柵藻KDN7

柵藻KDN7藻細胞密度在第0～3 d先升后降，但變化幅度不大，此階段的相對生長速率為0.155(遲滯期)；第3～5 d細胞密度由4.10×104個/L快速增至3.52×105個/L，相對生長速率為1.075(對數期)；第6 d由3.52×105個/L降至2.69×105個/L，相對生長速率為-0.134(衰亡期)?？梢?，整個培養期該藻經歷了一個相對完整的生長周期，細胞生長充分(圖2a)。

由亞硝態氮質量濃度趨勢線(圖2b)可知，亞硝態氮質量濃度先略微上升然后較快下降；第0～2 d，由1.000 mg/L升至1.033 mg/L，相對凈化速率為-0.016 mg/(L·d)，即每日產生亞硝態氮0.016 mg/L；第2～6 d，由1.033 mg/L降至0.692 mg/L，相對凈化速率為0.085 mg/(L·d)。

由氨氮質量濃度的趨勢線(圖2c)可知，氨氮質量濃度呈先降后升趨勢。第0～2 d，由1.999 mg/L降至0.086 mg/L，氨氮相對凈化速率為0.957 mg/(L·d)；第2～6 d，由0.086 mg/L迅速升至0.980 mg/L，相對凈化速率為-1.217 mg/(L·d)，即每日產生1.217 mg/L氨氮。

圖2 柵藻KDN7培養液中細胞密度(a)、亞硝態氮質量濃度(b)、氨氮質量濃度(c)的變化情況

比較氨氮質量濃度和亞硝態氮質量濃度趨勢線可知，在氨氮質量濃度快速下降階段(即第0～2 d)，亞硝態氮質量濃度輕微上升；在亞硝態氮質量濃度較快下降階段(即第3～6 d)，氨氮質量濃度卻以較快的速度升高。

2.1.2 三角褐指藻KDN13

三角褐指藻KDN13在接種后即迅速生長，細胞密度在第0～4 d由8.30×104個/L快速增至2.62×106個/L，相對生長速率為0.863(對數期)；第4～6 d，細胞密度略下降后又明顯增加，相對生長速率為0.193(穩定期)(圖3a)?？梢娬麄€培養期該藻經歷了一個相對完整的生長周期，細胞生長充分。

由亞硝態氮質量濃度趨勢線(圖3b)可知，第0～3 d，由1.000 mg/L升至1.051 mg/L，相對凈化速率為-0.025 mg/(L·d)，即平均每日產生亞硝態氮0.025 mg/L；第3～6 d，亞硝態氮質量濃度小幅波動，相對凈化速率為0.004 mg/(L·d)。

由氨氮質量濃度趨勢線(圖3c)可知,氨氮質量濃度呈先快速降低后緩慢升高的趨勢；第0～3 d，由2.003 mg/L降至0.013 mg/L，相對凈化速率為0.663 mg/(L·d)；第3～6 d，由0.013 mg/L緩慢升至0.068 mg/L，相對凈化速率為0.018 mg/(L·d)。

圖3 三角褐指藻KDN13培養液中細胞密度(a)、亞硝態氮質量濃度(b)、氨氮質量濃度(c)的變化情況

比較氨氮質量濃度和亞硝態氮質量濃度的趨勢線可知，三角褐指藻KDN13在其生長周期的前半段(第0～3 d)，氨氮質量濃度快速下降，亞硝態氮質量濃度緩慢上升；在其生長周期的后半段(4～6 d)，亞硝態氮濃度小幅波動，氨氮質量濃度則小幅緩慢上升。

2.1.3 雙眉藻KDN17

雙眉藻KDN17細胞密度在第0～2 d由2.30×104個/L增至7.80×104個/L，相對生長速率為0.28(遲滯期)；第2～5 d細胞度密度由7.80×104個/L快速增至4.50×106個/L，相對生長速率為2.028(對數期)；培養期最后的生長速率為0.265(穩定期)(圖4a)?？梢婋p眉藻在培養期經歷了一個相對完整的生長周期，細胞生長充分。

由亞硝態氮和氨氮質量濃度變化情況(圖4b～c)可知，第0～2 d，亞硝態氮和氨氮的質量濃度均快速下降，分別由1.002 mg/L和1.999 mg/L降至0.358 mg/L和0.081 mg/L，兩者的相對凈化速率分別為0.322 mg/(L·d)和0.959 mg/(L·d)；第2～6 d，亞硝態氮質量濃度先升至0.388 mg/L后降至0.305 mg/L，而氨氮質量濃度則由0.081 mg/L緩慢降至0.049 mg/L，此階段兩者的相對凈化速率分別為0.013 mg/(L·d)和0.008 mg/(L·d)。

圖4 雙眉藻KDN17培養液中細胞密度(a)、亞硝態氮質量濃度(b)、氨氮質量濃度(c)的變化情況

2.1.4 小新月菱形藻KDN18

小新月菱形藻KDN18細胞密度在第0～4 d由7.60×104個/L迅速增至2.504×106個/L，相對生長速率為0.874(對數期)；第4～6 d細胞密度由2.50×106個/L緩慢增加至2.96×106個/L，相對生長速率為0.041(穩定期)(圖5a)。

由亞硝態氮質量濃度的趨勢線(圖5b)可知，接種后第0～1 d，由0.998 mg/L輕微降至0.963 mg/L；第2～6 d由0.963 mg/L緩慢升至1.098 mg/L，相對凈化速率為-0.027 mg/(L·d)，即每日產生0.027 mg/L的亞硝態氮。

由氨氮質量濃度變化情況(圖5c)可知，氨氮質量濃度在第0～3 d由2.001 mg/L快速降至0.086mg/L，相對凈化速率為0.958 mg/(L·d)；在第2～4 d呈先降后緩慢上升趨勢，相對凈化速率為-0.009 mg/(L·d)，即每日產生氨氮0.009 mg/L。

圖5 小新月菱形藻KDN18培養液中細胞密度(a)、亞硝態氮質量濃度(b)、氨氮質量濃度(c)的變化情況

在氨氮快速下降的階段(第0～2 d)，亞硝態氮質量濃度先略降后略升；在亞硝態氮質量濃度緩慢上升階段(第2～6 d)，氨氮質量濃度也緩慢上升，但兩者上升的幅度均很小。

2.1.5 亞心形扁藻KDN20

亞心形扁藻KDN20細胞密度在第0～1 d略有上升，由1.00×104個/L升至1.60×104個/L，相對生長速率為0.470(遲滯期)；第1～5 d細胞密度由1.60×104個/L升至2.50×105個/L，相對生長速率為1.010(對數期)；第6 d由2.50×105個/L升至2.56×105個/L，相對生長速率為0.024(穩定期)(圖6a)?？梢妬喰男伪庠錕DN20在整個培養階段經歷了一個生長周期，細胞生長充分。

由亞硝態氮質量濃度的趨勢線(圖6b)可知，亞硝態氮質量濃度在第0～5 d總體呈緩慢下降趨勢，但下降幅度很小，此階段的相對凈化速率為0.019 mg/(L·d)，第6 d亞硝態氮質量濃度略為升高，相對凈化速率為-0.044 mg/(L·d)。

由氨氮質量濃度的趨勢線(圖6c)可知，氨氮質量濃度在第0～3 d由2.002 mg/L快速降至0.001 mg/L，相對凈化速率為0.667 mg/(L·d)，之后氨氮質量濃度一直維持在檢出最低限以下。

圖6 亞心形扁藻KDN20培養液中細胞密度(a)、亞硝態氮質量濃度(b)、氨氮質量濃度(c)的變化情況

整個培養期，無論是氨氮質量濃度快速下降階段，還是維持穩定階段，亞硝態氮質量濃度一直小幅度緩慢下降。

2.1.6 塔胞藻KDN21

塔胞藻KDN21細胞密度在第0～1 d略微增加，相對生長速率為0.100(遲滯期)；第2～4 d細胞密度由0.30×105個/L快速升至2.80×105個/L，相對生長速率為0.745(對數期)，第5～6 d細胞密度明顯下降，進入衰亡期(圖7a)?？梢娫撛逶? d的培養期內經歷了一個比較完整的生長周期。

由亞硝態氮質量濃度的趨勢線(圖7b)可知，亞硝態氮質量濃度在0～2 d緩慢下降，相對凈化速率為0.01 mg/(L·d)；第2～5 d亞硝態氮質量濃度下降較快，相對凈化速率為0.065 mg/(L·d)；第6 d亞硝態氮質量濃度略有上升，相對凈化速率為-0.014 mg/(L·d)。

由氨氮質量濃度的趨勢線(圖7c)可見，氨氮在第0～2 d快速由1.999 mg/L降至0.001 mg/L，相對凈化速率為0.999 mg/(L·d)，之后氨氮質量濃度一直低于檢出下限。

圖7 塔胞藻KDN21培養液中細胞密度(a)、亞硝態氮質量濃度(b)、氨氮質量濃度(c)的變化情況

亞硝態氮和氨氮質量濃度變化存在一定的先后順序：第0～2 d氨氮幾乎被完全凈化，而亞硝態氮質量濃度僅下降了0.019 mg/L；第3～6 d氨氮質量濃度均為0.000 mg/L，而亞硝態氮質量濃度總體上呈緩慢下降趨勢。

2.2 各微藻對氨氮、亞硝態氮凈化情況的比較

所有藻株對氨氮均表現出很好的凈化能力(圖8)，除柵藻KDN7外，所有藻株第3 d時的氨氮相對凈化率均達到95%以上且一直保持到試驗結束，柵藻KDN7的氨氮相對凈化率呈先快速升高后緩慢降低的變化趨勢，說明該藻前期能快速凈化氨氮，后期卻產生了一定量的氨氮；大部分藻株對亞硝態氮的凈化能力較弱，相對凈化率均未超過35%，有的藻株甚至產生了少量亞硝態氮(相對凈化率為負數)，只有雙眉藻KDN17具有較強的亞硝態氮凈化能力，第2 d時即能凈化64%的亞硝態氮，最高時對亞硝態氮的凈化率接近70%；除雙眉藻KDN17外，所有藻種的氨氮相對凈化率快速上升階段(第0～2 d)，亞硝態氮相對凈化率均很低，說明這些藻在快速凈化氨氮時，并不明顯凈化亞硝態氮；雙眉藻KDN17的氨氮相對凈化率快速上升時亞硝態氮相對凈化率也快速上升(第0～2 d)，說明此藻株能同時較快地凈化氨氮和亞硝態氮。

圖8 各微藻對氨氮、亞硝態氮的相對凈化率

3 討 論

3.1 混合無機氮源下微藻對氨氮和亞硝態氮的凈化規律

所有藻株在整個試驗期均生長充分，都經歷了一個相對完整的生長周期。在生長周期的初期(培養至第2～3 d)，所有藻均能快速凈化氨氮(相對凈化率均超過95%)，尤以柵藻KDN7最快，僅2 d即可將培養基中的氨氮消耗殆盡；大部分藻株對亞硝態氮的凈化能力很弱，相對凈化速率均未超過0.035 mg/(L·d)，只有雙眉藻KDN17能以每日凈化0.639 mg/L的速率較快地凈化亞硝態氮。在生長周期的中后期，絕大多數藻株的氨氮質量濃度保持在極低水平，但柵藻KDN7的氨氮質量濃度出現大幅度上升，日增加1.217 mg/L；各藻株對亞硝態氮的凈化能力仍然很弱，大部分微藻在此階段的相對凈化速率均低于0.010 mg/(L·d)，相對凈化率均未超過35%。上述結果表明，當水體中的氮源僅有3種無機態氮時，在以硝態氮滿足藻細胞充分生長的前提下，絕大部分微藻在生長初期均優先凈化氨氮；無論處于生長周期的哪個階段，大部分微藻對亞硝態氮的凈化能力都很弱。

3.2 利用微藻控制水產養殖水體亞硝態氮質量濃度的可能性

因施肥、細菌分解殘餌和糞便以及水產動物氮代謝，水產養殖水體中無機氮的最初形式主要是氨氮和硝態氮，水體中的氨氮在硝化作用下轉變為亞硝態氮和硝態氮，最終導致水體中同時存在氨氮、亞硝態氮和硝態氮[27]，這3類無機氮的含量因水體生物群落、投餌量、天氣等因素的影響處于不斷變化之中[28]。雖然亞硝態氮不穩定，在自然水體中的含量很低，但在高密度水產養殖中，由于硝化細菌活性失調和脫氮作用過程的不平衡均會引起亞硝態氮的過量產生[29-30]，給水產動物帶來危害。本次試驗表明，絕大部分微藻優先凈化氨氮，對亞硝態氮的凈化能力總是很弱。這一結果提示，當養殖水體的亞硝態氮含量已經超標，若想通過向水體中投入人工培養的藻種降低其含量，須選用那些能同時利用氨氮和亞硝態氮的藻株(如雙眉藻KDN17)才可能有效果。

3.3 微藻利用硝態氮過程中積累亞硝態氮或氨氮的可能性

作為一類低等植物，微藻對硝態氮的同化過程類似于植物[31]，即在硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的先后作用下將NO3-還原為NO2-再還原為NH4+，最后NH4+分別在谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的作用下形成谷氨酰胺和谷氨酸，實現從無機氮到有機氮的同化過程。從這一代謝過程可見，微藻細胞在將硝態氮轉化為氨氮的過程中出現亞硝態氮和氨氮的積累是有可能的。

有研究報道[32]，某些藻類在利用硝態氮時之所以會出現亞硝態氮積累，是因為硝酸還原酶和亞硝酸還原酶分別在細胞漿和葉綠體內發揮作用，兩者的反應過程并非同步進行，而且硝酸還原酶的活性隨著培養基中硝態氮含量升高而升高，當硝態氮過多導致產生過多的亞硝態氮，亞硝酸還原酶來不及將亞硝態氮還原為氨時，就會產生亞硝態氮積累。王倩雅等[13]的研究表明，尖狀柵藻(S.acuminatus)在初始硝酸鈉濃度為18.0、9.0、6.0、3.6 mmol/L的培養液中培養時，前2 d均出現亞硝態氮濃度升高的現象，亞硝態氮濃度最高達到硝態氮濃度的1%。馬紅芳等[21]在用柵藻LX1處理水產養殖廢水(含氨氮5.75 mg/L、亞硝態氮0.63 mg/L、硝態氮20.15 mg/L)時也發現類似情況，接種藻種后培養至第1 d時亞硝態氮質量濃度明顯升高，由最初的0.63 mg/L升至1.90 mg/L，之后逐漸下降，培養至約第12 d，水中亞硝態氮含量才開始低于初始值。本研究中，三角褐指藻KDN13和小新月菱形藻KDN18在耗盡氨氮后，藻細胞密度仍呈對數增長，培養液中的亞硝態氮質量濃度不降反升，到試驗結束時，兩種藻液中亞硝態氮質量濃度比初始值分別增加了3.70%和10.02%，說明兩株藻在利用硝態氮維持對數生長的過程中累積了少量亞硝態氮。

另外，本研究中，柵藻KDN7氨氮質量濃度在降至0.086 mg/L之后逐漸上升，至培養結束時升至0.980 mg/L(圖2)，總上升量為0.894 mg/L，同期亞硝態氮質量濃度由1.033 mg/L降至0.692 mg/L(圖2)，下降了33.01%。顯然在氨氮幾乎被耗盡后，柵藻KDN7利用硝態氮和亞硝態氮維持其自身生長的同時，也產生了一定量的氨氮，這提示某些微藻在同化亞硝態氮或硝態氮時可能產生氨氮積累。由于尚未見到類似報道，有必要對此現象做更多研究，以進一步揭示水體無機氮的轉換途徑。