基于網絡藥理學的半夏瀉心湯對治療胃癌的作用機制

鐘 嬋，張 濤，黃李冰雪，徐文華，陳遠能*

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530000；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院消化內科，廣西 南寧 530000）

半夏瀉心湯出自東漢著名醫學家張仲景所撰《傷寒論》，由半夏、黃芩、黃連、炙甘草、干姜、人參、大棗七味藥組成，方中重用半夏和胃降逆止嘔，為全方之君藥；黃芩、黃連苦寒泄熱；干姜、半夏辛溫散寒，寒熱并用，辛開苦降；更佐人參、大棗、炙甘草補益脾胃，共達調和中焦脾胃升降之功；本方為少陽誤下成痞所設，是辛開苦降、寒溫并用、攻補兼施、調和脾胃的代表方劑［1］。因其配伍精當，效專力宏，故后世廣泛應用于各種消化系統疾病的治療。胃癌（gastric cancer）系指源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，以胃腺癌居多，居全球惡性腫瘤發病率、死亡率前列。胃癌起病隱匿，其發病是多基因、多因素、多步驟參與的復雜病理過程。諸多研究證實半夏瀉心湯不僅抑制胃癌細胞的增殖、促進胃癌細胞凋亡，還能治療胃癌前病變、緩解化療胃腸道反應的療效［2-4］。由于胃癌涉及多基因的突變，不能通過干預單一靶點而奏效，而中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑的特性，遵從“君、臣、佐、使”的配伍原則。因此開展中藥復方防治胃癌的研究顯得尤為重要。由于網絡藥理學的興起，使近年來現代生物醫藥研究的發展飛躍，且在分子生物學水平中引領潮流。如今從單靶點、單藥物研究模式進展為多靶點、多成分體系。網絡藥理學是是基于“疾病-基因-靶點-藥物”的相互作用網絡，善于多向，側重整體，全方位識別內外刺激信號的應答，使研發的新藥的有效成分能增加靶向疾病作用的機會，進而到達抑制腫瘤的作用。本研究通過網絡藥理學技術，分析半夏瀉心湯對治療胃癌的作用機制，深入開展半夏瀉心湯防治胃癌必將為中醫現代化提供堅實的證據和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 半夏瀉心湯化合物的收集 在中藥系統藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology TCMSP）平臺（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）搜索半夏瀉心湯7 味全方的所有化合物，共取得1 058 個化合物，包括大棗133 個、人參190 個、干姜148 個、黃連48 個、黃芩143 個、半夏116 個、甘草280 個，為研究該中藥方的活性成分奠定基礎。

1.2 半夏瀉心湯活性成分的篩選 根據篩選閾值口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30% 和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18，從半夏瀉心湯7 味全方中的1 058個化合物中篩選出211 個候選化合物，說明這些候選化合物具有較高的活性成分。

1.3 化合物-靶點網絡的構建及拓撲學性質分析 將收集的中藥化合物和靶點通過Cytoscape 3.4.0 軟件（http：//www.cytoscape.org/）構建化合物-靶點網絡。在該網絡中篩選自由度（degree centrality，DC）較高的節點和相應的介數（closeness centrality，CC）進行拓撲分析，以明確關鍵的化合物或者靶點。

1.4 交集靶點的獲取 結合Comparative Toxicogenomics Database（CTD）、GeneCards、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）3 個數據庫建立的疾病靶點，應用Venny2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）軟件獲取中藥有效成分與疾病的交集靶點，以探究半夏瀉心湯的有效成分對胃癌靶點的靶向作用。

1.5 構建半夏瀉心湯靶點蛋白相互作用（PPI）網絡 將獲得的交集靶基因導入String10.0 軟件（http：//string-db.org），選取置信度高于0.9 的數據，再將文本數據導入Cytoscape 中進行節點大小和顏色的調整，完整構建半夏瀉心湯的作用靶點PPI 網絡，從而知曉哪些關鍵蛋白在網絡中起調控作用。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能與KEGG 通路富集分析 采用David v 6.7 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對交集靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，通過Omicshare 云平臺（http：//www.omicshare.com/）從KEGG 通路富集分析中篩選出Top20 相關信號通路。以闡明半夏瀉心湯的化學成分對胃癌靶點具有一定的生物功能，以及在相關信號通路中的起調控作用。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選 根據TCMSP 平臺中OB 和DL 的界定值和去重處理，本研究共納入164 個活性化合物（表1）。

表1 半夏瀉心湯中含有的164 個活性化合物基本信息

續表1

續表1

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2.2 半夏瀉心化合物-靶點調控網絡 由309 個節點（164個化合物節點和145 個靶點節點）和2 156 條邊構建的化合物-靶點網絡（圖1）。在該網絡中，藍色節點表示化合物分子，黃色節點表示藥物靶點，每條邊代表化合物與靶點之間的靶向作用關系。網絡中和節點相連的邊數代表一個節點的度值（Degree）。根據Degree 值較高的節點及對應的介數值進行拓撲學性質分析，連接條數最多和集中較密集的化合物和靶點在該網絡中起主導作用，即最核心的化合物或者靶點（表2）。分析數據表明，每個化合物的平均靶點數目為13 個，每個靶點平均與15 個化合物相互作用，由此說明半夏瀉心湯具有多成分、多靶點的作用，同時也符合中藥復方的特性。從化合物來看，有60%的化合物的作用靶點≥15 個，其中有39 個化合物的靶點≥20 個。甘草中的槲皮苷（M98）的作用靶點數最高，能與70 個靶點蛋白發生相互作用；人參中的山柰酚（M422），含有靶點蛋白38 個；大棗中的Stepholidine（M627）和黃連中的（R）-四氫小檗堿（M2903）都與27 個靶點蛋白發生相互作用。其次半夏中的Cavidine（M2670）和黃芩中的漢黃芩素（M173）皆作用于26 個靶點蛋白。從靶點角度來看，連接度最高的為前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2），靶向137 個化合物。緊鄰的是鈣調蛋白2（Calmodulin 2，CALM2）靶向100 個化合物。而凝血因子VII（Coagulation factor VII，F7）靶向97 個化合物。

2.3 中藥有效成分與疾病靶點的Venny 分析 從CTD、Genecards、OMIM 3 個數據庫篩選出的911 個胃癌相關靶點，與半夏瀉心湯的143 個作用靶點取交集，獲得84 個交集靶點（圖2）。

圖1 半夏瀉心湯化合物-靶點調控網絡

2.4 半夏瀉心湯靶點PPI 網絡的構建與分析 運用String數據庫和Cytoscape 軟件共同建立了半夏瀉心湯靶點PPI 網絡（圖3）。該網絡涉及84 個蛋白質節點和192 條連線。用節點的大小和顏色表示Degree 值的大小，節點越大對應的Degree 值越大，顏色由紅變藍對應的Degree 值越大。用邊的粗細表示Combine score 值的大小，邊越粗Combine score 值越大。根據Degree≥10 的節點制作出前10 個關鍵蛋白質節點的條形圖（圖4），其中關鍵節點包括JUN、TP53、MAPK1、MAPK14、MAPK3、VEGFA、IL6、ESR1、PTGS2、TNF。這進一步說明這些關鍵蛋白是該網絡的核心，掌控著整個網絡的重要節點。

表2 化合物-靶點網絡的關鍵節點及其拓撲學性質

圖2 中藥有效成分與疾病的交集靶點

2.5 GO 富集與KEGG 通路富集分析 將84 個交集靶基因導入DAVID 數據平臺進行GO 和PATHWAY 富集分析（圖5～7）。該富集分析過程中，共獲取213 個GO 條目，生物過程占143 個，分子功能占41 個，細胞組成占29 個。根據P＜0.01，取排名前10 的條目分別建立餅狀圖、折線圖、條形圖。其中生物過程涉及RNA 聚合酶II 啟動子、藥物級聯反應、缺氧誘導、一氧化氮生物合成過程、DNA 結合轉錄因子活性的調控、DNA 模板、MAPK 信號激活、氧化還原過程、細胞轉錄的調控、基因表達的調控、毒性物質應答等方面；分子功能涉及酶結合、類固醇結合、藥物結合、血紅素結合、MAP 激酶活性、類固醇激素受體活性、蛋白質同源二聚體活性等方面；細胞組成涉及胞外間隙、線粒體、細胞膜表面、溶酶體等方面。采用Omicshare 軟件構建PATHWAY 富集分析氣泡圖（圖8），共篩選出75 條通路，根據P＜0.01，取排名前20 的通路，主要涉及癌癥信號通路、TNF-α 信號通路、HIF-1 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、FoxO 信號通路等，由此說明半夏瀉心湯的化學成分可干預與這些通路來達到防治胃癌的效用。

圖3 半夏瀉心湯靶點PPI 網絡

3 討論

歷代醫家認為胃癌病機當責之于虛、郁、痰、瘀、毒，以痰瘀郁毒，陰傷氣耗，虛實夾雜以及氣郁為主要病機，與體質內虛、六淫邪毒、七情內、血瘀、痰結、濕聚、熱毒等多種病理產物相互糾結，導致機體陰陽失調，臟腑、經絡、氣血功能障礙，日久引起病理產物聚結，留滯不去，聚而成癥而發生質的改變，傷、飲食失調、素有舊疾等因素相關；在正虛的基礎上，氣郁形成有形之腫塊［5］。半夏瀉心湯由半夏、黃芩、干姜、人參、黃連、大棗、炙甘草7味藥組成，方中以辛溫之半夏為君，散結除痞，又善降逆止嘔；臣以辛熱之干姜以溫中散寒，苦寒之黃芩、黃連以泄熱開痞；又以人參、大棗甘溫益氣，以補脾虛，為佐藥；使以甘草補脾和中而調諸藥。全方寒熱互用以和其陰陽，苦辛并進以調其升降，補瀉兼施以顧其虛實。使寒去熱清，升降復常。則痞滿可除，嘔利自愈［6］。

圖4 PPI 網絡的關鍵蛋白節點

圖5 生物過程富集分析

圖6 分子功能富集分析

圖7 細胞組成富集分析

圖8 Pathway 富集分析

通過本研究PPI 網絡結果提示作用于胃癌細胞的關鍵靶點涉及 JUN、TP53、MAPK1、MAPK14、MAPK3、VEGFA、IL6、ESR1、PTGS2、TNF。c-JUN 是原癌基因（其蛋白為JUN），是病毒癌蛋白v-jun 的細胞同源物，JUN是第一個被發現的致癌轉錄因子。c-JUN 對紫外線誘導的細胞凋亡有保護作用，并與NF-κB 協同作用抑制了TNF-α 誘導的細胞凋亡［7］。腫瘤抑制基因P53（Tumor protein P53，TP53）被稱為“基因組的守護者”，是人類癌癥中最常見的突變基因（＞50%）。當DNA 發生持續損傷時，TP53 可以激活DNA 修復蛋白，若無法修復，即可引發細胞凋亡（即程序性細胞死亡）；TP53 還能將細胞周期保持在DNA損傷識別的G1/S 調控點而停止生長，說明TP53 在維持基因穩定和預防癌癥形成方面起著重要的作用［8］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一組能被不同的細胞外刺激，如細胞因子、神經遞質、激素、細胞應激及細胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，調節著細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理病理過程［8］。實驗表明，MAPK14 和MAPK3/1 通路具有控制惡性腫瘤的遷移和增殖［9］。前列腺素合成酶（PTGS2）的表達通常被稱為環氧化酶2（COX2），其表達受MAPK3/1 的調節［9］。PTGS2 是前列腺素生物合成過程中的關鍵酶，與炎癥和有絲分裂有關的前列腺素生物合成有關，與PTGS2 相關的疾病涉及消化性潰瘍疾病，PTGS2 的上調與細胞黏附增加、表型改變、抗凋亡和腫瘤血管生成有關［10］。在腫瘤細胞中，PTGS2 是前列腺素E2（PGE2）產生的關鍵步驟，在調節細胞的運動、增殖和抗凋亡等方面起著重要的作用［11］。血管內皮生長因子A（VEGFA）被認為是參與腫瘤血管生成和腫瘤形成的最強有力的細胞因子，腫瘤血管生成通過調節氧氣、營養物質和生長因子向腫瘤細胞的輸送，在實體腫瘤的生長、侵襲和轉移擴散中發揮至關重要的作用［12］。研究闡明VEGFA 存在于不同的人胃癌細胞系上清液中，VEGFA 信號通路的激活促進了胃癌的生長和轉移［13］。據報道，胃腫瘤及血液循環中VEGF-A 水平與疾病程度、復發及生存密切相關［14］。雌激素受體（Estrogen Receptor，ESR1）是一種配體激活的轉錄因子，由激素結合、DNA 結合和轉錄激活有關的結構域組成，其控制許多細胞過程，包括生殖系統的生長、分化功能，骨骼的生長和維持以及心血管和神經系統的正常功能。研究發現ESR1 具有調控細胞增殖、遷移和凋亡的作用［15］。白細胞介素6（Interleukin 6，IL-6）是一種在炎癥和B 細胞成熟過程中起作用的細胞因子，胃癌組織中M2 巨噬細胞的表達與IL-6 的表達呈正相關［16］。腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）是一種多功能的促炎細胞因子，屬于TNF 超家族。這種細胞因子參與調節廣泛的生物學過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、脂質代謝和凝血，TNF 與自身免疫性疾病、胰島素抵抗和癌癥等疾病相關［17］。由此說明半夏瀉心湯的有效成分可與胃癌相關靶點相互作用，基于中藥復方多成分、多靶點、多途徑的優勢，進一步發揮了防治胃癌的效用。根據KEGG 通路分析提示胃癌相關通路涉及低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1 信號通路、TNF-α 信號通路等。HIF-1 是對細胞低氧非常敏感的特意性轉錄因子，它是機體耐受低氧最重要的物質，可能與胃癌的發生有關［18］。在細胞水平上，低氧使細胞抑制氧化磷酸化水平，ATP 的生成主要依賴加快糖酵解速度來實現，這樣可降低細胞的氧消耗，為適應這種轉變，細胞上調與糖酵解有關酶和葡萄糖轉運蛋白的表達；在系統水平上，局部組織細胞低氧還可提高VEGF 水平，VEGF 作用在內皮細胞上，刺激新血管的形成，以維持局部氧的供應。實驗表明，HIF -1α 表達下調可顯著抑制胃癌的惡性表型［19］，低氧誘導胃癌細胞失活，糖原合成酶激酶-3b（GSK-3b）可能通過負性調節HIF-1a/VEGF 信號通路而抑制胃癌血管生成和腫瘤生長［20］，胞核HIF-1α 陽性與胃癌患者不良預后相關［19，21］。近期的研究還發現，TNF-α 所誘導的JNK 途徑和NF-κB 途徑具有協同性［7］，即如果抑制NF-κB 途徑則可以增強JNK 的細胞凋亡反應，反之亦然。TNF-α 是主要的炎性細胞因子，其通過調節炎癥，細胞增殖、分化、存活和死亡來維持內穩態。TNF 既可誘導細胞死亡，也能促使細胞存活和促炎細胞因子的產生。TNF/ TNFR1 誘導至少兩種細胞信號傳導復合物，其中受體相關的質膜復合物（復合物I），激活NF-κB和MAPK 以及轉錄和翻譯；胞質復合物（復合體II），其作用是啟動細胞死亡；TNFR1 被刺激后，迅速募集TRADD（TNF receptor-associated death domain），TRAF2（TNF-receptor-associatedfactor2），RIPK1（recep-tor-interacting protein）和細胞凋亡抑制劑cIAP1 和cIAP2（Inhibitor ofapoptosis）組裝復合物I；RIPK1 和復合物I 的其它組分被cIAP 快速泛素化；泛素（Ub）與RIPK1 和復合物I 組分的結合引起轉化生長因子激酶1（TAK1）介導的IKK2，JNK，ERK 和p38α的活化；復合物I 的形成引起NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活，其最終導致細胞因子和促生存蛋白如cFLIP［Fas-associated death domain-like interleukin-1β-converting enzyme（FLICE）-like inhibitory protein］的產生，其是協調炎癥反應所必需的；復合物I 形成之后，TNF 還啟動基于RIPK1 的細胞質復合物的形成，即復合物II，復合物II 通過激活caspase-8 引發細胞凋亡，或通過RIPK3 和MLKL，引起細胞壞死［22］。研究發現，TNF-α-238G/A 多態性與亞洲人，特別是中國人患胃癌的風險增加有關［23］。PI3K（Phosphatidylinositide 3-kinases），是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，由調節亞基p85 和催化亞基p110 構成。PI3K 通過兩種方式激活，一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構象改變而被激活；另一種是通過Ras 和p110 直接結合導致PI3K 活化，活化的PI3K 產生第二信使3，4，5-三磷酸磷脂肌醇PIP3，PIP3 與細胞內含有PH 結構域的信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）和磷酸肌醇依賴激酶（PDK1）結合，改變Akt的蛋白結構，使之移位到細胞膜，可使膜上的PDK21 和PDK-2 發生蛋白磷酸化，促使PDK1 磷酸化的Ser308 導致Akt 活化?；罨腁kt 通過磷酸化作用激活或抑制其下游一系列底物如Bad（Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter）、Caspase9、NF-κB 等改變，從而調節細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。Rong Yan 等發現LRIG1 可激活EGFR/PI3K/Akt 信號通路，誘導胃癌細胞凋亡。miR-4295 上調EGFR、PI3K、Akt、p-PI3K 和p-Akt的表達，提示miR-4295通過靶向節LRIG1（leucine-rich repeats and immunoglobulinlike domains 1）的表達，激活EGFR/PI3K/Akt 信號通路，從而促進胃癌細胞增殖，誘導胃癌細胞凋亡［24］。FOXO 轉錄因子家族成員包括FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6，FOXO［25］。FOXO 在增殖、凋亡、分化、抗應激和代謝反應在內的多種細胞過程中起著至關重要的作用［25］。Yang等［26］，Su 等［27］分別發現FOXO3 和FOXO4 的表達缺失與胃癌的生長和轉移密切相關，可能成為胃癌治療的潛在靶點。因此，推測半夏瀉心湯活性成分可能靶向作用于上述信號通路中的關鍵因子從而達到治療胃癌的目的。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學從系統層面來揭示半夏瀉心湯治療胃癌的藥理作用機制。推測該方活性成分在缺氧誘導，細胞凋亡、周期、分化、增殖、遷移、侵襲和血管生成等環境下能發揮顯著的藥效。中藥不以消除腫瘤為終極目的，更強調人瘤共存、改善癥狀的特點，但中藥復方防治胃癌的客觀證據及科學評價還有漫長的研究之路，由此，探討半夏瀉心湯防治胃癌的研究必將為中醫藥現代化提供堅實的證據和實驗支持。