芹菜汁發酵條件優化及替代亞硝酸鹽對調理豬肉餅品質的影響

王吉，武佳文，張昊，朱迎春

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中030801）

亞硝酸鹽是腌肉制品加工過程中普遍使用的一種食品添加劑，它在加工過程中起著發色、抑制肉毒梭狀芽孢桿菌生長、抗氧化和呈現特殊風味的作用[1-2]，而且也是目前已知的唯一一種在腌肉制品中能同時起到以上4種作用的物質。但是在烹調或其他條件下，肉制品中的亞硝酸鹽可與氨基酸發生降解反應，生成具有強致癌性的亞硝胺[3]。

美國農業部規定[4]，凡是標有“有機”和“天然”標簽的肉制品，不允許含有人工合成型化學物質或者添加劑，比如亞硝酸鹽、異抗壞血酸鈉等。因此，研究人員尋求化學合成型亞硝酸鹽的天然代替物，“天然腌制”的概念被學者提出：利用某些微生物使得硝酸鹽含量高的蔬菜中的硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，制成蔬菜汁（粉），添加到肉制品中。Yilmaz等應用番茄汁在低脂熟制香腸中[5]，Candogan等應用番茄醬在牛肉餅中[6]，Krause等[7]應用發酵芹菜粉于灌腸中均取得較好效果。Riel等[8]把香芹汁粉加入意大利香腸中，對微生物、理化及感官品質加以考察，認為香芹粉可以替代人工合成型亞硝酸鹽。

目前，應用在發酵肉制品領域的商業復合菌種種類較多，部分菌種具有硝酸鹽還原能力，但是如何利用商業型復合菌種生產天然腌制肉，目前報道較少。本文首先以3種復合菌種為發酵劑發酵芹菜汁，篩選將芹菜中富含的硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽的最佳發酵條件，然后將最優條件下發酵的芹菜汁添加到調理豬肉餅中，研究發酵芹菜汁（fermented celery juice，FCJ）對調理豬肉餅品質特性的影響，探究天然亞硝酸鹽取代人工合成亞硝酸鹽的可能性，為實際生產和應用提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉：山西農業大學雙匯冷鮮肉專賣店；新鮮芹菜、香辛料、白糖：山西農業大學農貿市場；食鹽、花椒、醋、料酒、白糖、胡椒粉、五香粉、香油、雞精、生姜粉、玉米淀粉等均為食品級：山西農業大學寸草心超市。

硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖、冰乙酸、氧化鎂、硼酸、三氯乙酸、丁基羥基茴香醚、乙二胺四乙酸、2-硫代巴比妥酸、氯仿、復合磷酸鹽、氫氧化鈉、抗壞血酸鈉（均為分析純）：天津化學試劑一廠。

1.2 主要儀器與設備

SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海躍進醫療器械廠；FA2004電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；HH-S8電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；WFJT200紫外/可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；JS39D-250榨汁機：浙江蘇泊爾股份有限公司；PHB-4型pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；3K15型高速冷凍離心機：德國Sigma公司；CR-400型色差儀：日本Minolta公司；HY-2調速多用振蕩器、79-1型磁懸浮攪拌器：常州國華電器有限公司；FA25高剪切分散乳化機：上海弗魯克流體機械制造有限公司；600型真空包裝機：晉中佳通機電科技有限公司；JD31A847A電餅鐺：蘇泊爾股份有限公司。

1.3 供試發酵劑

發酵劑購自意大利丹尼斯克公司，每袋20 g，總菌數為1.0×1012CFU，均為復合菌種。lyocarni SBM-52型發酵劑由木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌組成；lyocarni SHI-59型發酵劑由木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳酸菌組成；lyocarni VBM-60型發酵劑由木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌組成。

1.4 試驗方法

1.4.1 芹菜汁的制作與發酵

芹菜汁的制作：將購買的新鮮芹菜清洗、瀝水、切碎、加入同質量的水榨汁過濾后得到芹菜汁。

芹菜汁的發酵：準備若干潔凈的500 mL錐形瓶，每個錐形瓶中加入芹菜汁、發酵劑、葡萄糖，調節pH值，恒溫發酵，且每隔2 h調一次pH值，分別在0、12、24、36、48、60 h 測定亞硝酸鹽含量。

1.4.2 調理豬肉餅制作

調理豬肉餅的基本配方：以絞碎豬肉500 g計（肥瘦比為2∶8），食鹽 8 g、玉米淀粉 68 g、復合磷酸鹽2 g、白糖 5 g、醋 20 g、抗壞血酸鈉 0.5 g、料酒 20 g，充分攪拌均勻。將肉餡用模具制成肉餅，每個質量為（50±5）g。每個肉餅均用尼龍/聚乙烯袋[23℃時，透氧性90 mL/（m2·24 h）]真空包裝，之后貯藏于冰溫條件（-1.5±0.5）℃。每隔6 d進行品質分析，直到出現表面發黏、色澤灰暗、氣味異常時為止。

1.5 試驗設計

試驗分為兩部分。第一部分通過單因素試驗篩選能將芹菜中硝酸鹽最大程度轉化為亞硝酸鹽的發酵條件。試驗分別設計為發酵劑種類lyocarni SBM-52、lyocarni SHI-59、lyocarni VBM-60；發酵溫度 25、30、35、40 ℃，發酵劑添加量 3.125×104、6.25×104、1.25×105、2.5×105、5.0×105CFU/mL 和 pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 為單因素水平。

第二部分研究發酵芹菜汁替代亞硝酸鹽對調理豬肉餅品質特性的影響。調理豬肉餅的分組情況為：空白對照（control check，CK）組：既不添加亞硝酸鈉，也不添加發酵芹菜汁；亞硝酸鈉對照（nitrite，NT）組：添加150 mg/kg的亞硝酸鈉；FCJ組：添加芹菜汁。經測定發酵芹菜汁中亞硝酸鹽含量為1 357.45 mg/kg，按照生產要求亞硝酸鈉最大添加量不超過150 mg/kg計算，調理豬肉餅制作時加入發酵芹菜汁的量為110.5 g/kg（對照加以同等質量的無菌水）。

1.6 指標測定方法

1.6.1 亞硝酸鹽測定方法

采用GB 5009.33-2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中分光光度法測定。

1.6.2 脂肪氧化程度測定

硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的測定參考 LizaJohn 等[9]的方法。

1.6.3 揮發性鹽基氮的測定

參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》的方法進行測定。

1.6.4 pH值的測定

參照GB 5009.237-2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》的方法進行測定。

1.6.5 色差值的測定

制備均勻樣品，平鋪在色差平皿底部，將色差儀進行白板校正后檢測其亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）值。

1.6.6 生物胺的測定

生物胺的測定參照黨曉燕等[10]的方法進行。

1.6.7 感官評價

感官評定的方法：將豬肉餅置于電餅鐺中烤制至中心溫度達到75℃，立即請10名專業人員組成的感官評定小組進行感官評分。評價標準包括肉餅的色澤、質構、多汁性、酸敗味、整體接受性5項，每項指標分值為1分～10分。對于色澤，1=灰暗，10=鮮亮；對于質構，1=粗糙，10=光滑；對于多汁性，1=干燥，10=多汁；對于酸敗，1=嚴重的刺激氣味，10=感覺不到；對于整體接受性，1=低，10=高，總分50分。

1.7 數據處理

試驗均設3次重復，結果用平均值±標準差表示，采用Microsoft Excel 2007軟件對試驗數據進行統計分析，Sigma plot 10.0繪圖軟件繪圖，并應用statistics 8.1中Turkey HSD程序進行顯著性差異分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 芹菜汁發酵條件的優化

不同發酵條件對芹菜汁中亞硝酸鹽含量的影響見圖1。

圖1 不同發酵條件對芹菜汁中亞硝酸鹽含量的影響Fig.1 Effect of different fermentation conditions on the content of nitrite in celery juice

由圖1A可知，發酵0～12 h，4組芹菜汁中亞硝酸鹽含量均快速增加，達到高于500 mg/kg的水平，并在發酵中后期（24 h～60 h）維持該水平不變（P＞0.05）。4組FCJ比較，發現接種發酵劑lyocarni VBM-60轉化亞硝酸鹽的能力最強，發酵12 h該組亞硝酸鹽含量達到峰值，為754.98 mg/kg，并在后續的發酵過程中亞硝酸鹽含量維持在700 mg/kg之上，顯著高于其他組（P＜0.05）。lyocarni VBM-60發酵劑由木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌組成，研究顯示，肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌應用到發酵肉制品中，除了有利于干發酵香腸成熟過程中風味物質的形成和脂質氧化程度的控制外，作為非乳酸菌發酵劑，含有較強的硝酸鹽還原酶活性，能夠將硝酸鹽轉化成亞硝酸鹽[11]。lyocarni VBM-60發酵劑效果最好，這可能是因為和其他兩種發酵劑比較，lyocarni VBM-60發酵劑中硝酸鹽還原菌所占比例更高的緣故。

由圖1B可知，發酵溫度是影響芹菜汁中亞硝酸鹽含量的一個重要因素。在發酵過程中，雖然4組芹菜汁中亞硝酸鹽含量都呈現先顯著增加后略有降低的趨勢，但是發酵溫度不同，亞硝酸鹽含量達到峰值的高低和出現的時間點不同，35℃和40℃發酵的峰值出現在第12小時，而25℃和30℃的峰值在第24小時出現，即發酵溫度高，峰值出現時間早，但亞硝酸鹽轉化率降低，特別是發酵溫度為40℃時，較高的溫度抑制了發酵菌株的活力，所以亞硝酸鹽轉化率也較低。當發酵溫度為30℃時，芹菜汁中亞硝酸鹽的含量可高達 712.06 mg/kg（24 h），顯著高于其他 3 組（P＜0.05）。

由圖1C可知，不添加發酵劑的對照組，依靠芹菜中自身的微生物，硝酸鹽也可轉變為亞硝酸鹽，但是發酵劑的添加明顯促進了亞硝酸鹽的轉化。發酵劑添加量為3.125×104CFU/mL時，亞硝酸鹽轉化率最高，其含量達到1 055.76 mg/kg（24 h）。隨著添加量的增加，亞硝酸鹽含量并沒有升高反而有所降低，這表明3.125×104CFU/mL的添加量是最合適的。

由圖1D可知，發酵pH值顯著影響芹菜汁中亞硝酸鹽的生成量。pH 4.5～5.0的發酵環境使發酵菌株產生的亞硝酸鹽還原酶的活力較弱，且生成的亞硝酸鹽還有可能發生酸降解，導致亞硝酸鹽含量減少[12]。發酵過程不調節pH值的FCJ亞硝酸鹽含量波動較大且在發酵后期顯著降低（P＜0.05）。調節pH值并在發酵過程中維持恒定有利于亞硝酸鹽的轉化。發酵過程中pH恒定維持為6.0時，芹菜汁亞硝酸鹽生成量最高，達到1 357.45 mg/kg（48 h）。

通過上述試驗得出芹菜汁最佳發酵條件為接種VBM-60型發酵劑，發酵溫度30℃，發酵劑添加量3.125×104CFU/mL，發酵 pH 值維持恒定 6.0，發酵48 h，芹菜汁中的亞硝酸鹽含量升到最高值，為1 357.45 mg/kg。

2.2 發酵芹菜汁對調理豬肉餅品質的影響

2.2.1 發酵芹菜汁對調理豬肉餅感官品質的影響

肉制品在貯藏過程中的可接受性依賴于它的感官變化，隨著貯藏時間的延長，在自身內源酶及外來微生物的作用下，蛋白質、氨基酸和其他含氮物質會被分解成為氨、三甲胺、硫化氫及吲哚等低級產物，產生具有腐敗特征的臭味而失去食用價值[13]。發酵芹菜汁對調理豬肉餅感官品質的影響如圖2所示。

貯藏前期（0～12 d），3組調理肉餅均很好地保持了其新鮮的品質（感官評分>40分，總分為50分），而且不同處理組之間沒有顯著性差異（P>0.05）。隨著貯藏時間的延長，調理肉餅新鮮度明顯下降。貯藏24 d時，CK組色澤暗，咀嚼性差，有輕微的腥臭味出現，不再適于食用而進入到腐敗階段（感官評分＜30分）。而NT組和FCJ組在冰溫貯藏24 d時仍維持在可食用范圍之內。NT組與FCJ組比較，咀嚼性、汁液、香味都無明顯差異，但從色澤來看，FCJ組因為添加了芹菜汁，色澤相對較暗。通過感官評定可知CK組、NT組和FCJ組調理肉餅分別在18、30 d和24 d達到感官可接受期限的極限點。

圖2 發酵芹菜汁對調理豬肉餅中亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.2 Effect of fermented celery juice on sensory quality in readyto-eating pork patty

2.2.2 發酵芹菜汁對調理豬肉餅中亞硝酸鹽殘留量的影響

圖3為發酵芹菜汁對調理豬肉餅中亞硝酸鹽殘留量的影響。

圖3 發酵芹菜汁對調理豬肉餅中亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.3 Effect of fermented celery juice on nitrite residue in readyto-eating pork patty

由圖3可知，在貯藏期間，3組亞硝酸鹽殘留量在第6天之前明顯降低（P＜0.05），之后基本維持穩定。3組進行比較，不添加亞硝酸鹽的CK組由于自身微生物的分解作用，肉餅中殘留1.34 mg/kg～5.49 mg/kg的亞硝酸鹽，而NT組和FCJ組的亞硝酸鹽殘留量則在前期顯著下降的基礎上維持在10.08 mg/kg～12.75 mg/kg和7.71 mg/kg～8.86 mg/kg的水平，且FCJ組的亞硝酸鹽殘留水平始終低于CK組。相關文獻對添加韭蔥粉發酵香腸[14]、芹菜粉乳化香腸[15]亞硝酸鹽殘留量進行了研究，均顯示其中亞硝酸鹽殘留量要低于添加化學型亞硝酸鹽的香腸，并且最終保持平衡，與本試驗研究結果類似。上述結果也表明使用富含硝酸鹽的蔬菜汁代替無機亞硝酸鹽的添加會賦予產品更高的安全性。

2.2.3 發酵芹菜汁對調理豬肉餅中TBARS值的影響

TBARS值反映脂質過氧化程度，涵蓋了大部分氧化反應產生的醛酮類物質，因而常作為判定脂質過氧化程度的指標[16]。圖4為發酵芹菜汁對調理豬肉餅TBARS值的影響。

圖4 發酵芹菜汁對調理豬肉餅中TBARS值的影響Fig.4 Effect of fermented celery juice on TBARS value in readyto-eating pork patty

由圖4可知，TBARS值隨著貯藏時間的延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。其中，CK組TBARS值顯著高于其他兩組（P＜0.05）。第24天時，CK組TBARS值為0.62 mg/kg，而NT組和FCJ組分別為0.41 mg/kg和0.48 mg/kg且差異不顯著（P>0.05），顯示出較好的抗氧化活性。李沛然等[17]考察發酵芹菜粉在灌腸中的應用效果，發現試驗組灌腸的TBARS值低于對照組。孫冬梅等也研究了芹菜中黃酮類物質的抗氧化活性，并將芹菜粉應用到肉制品中，發現芹菜粉是一種有效的自由基清除劑，可降低肉制品的TBARS值[18]。但在后期的貯藏過程中，NT組的抗氧化性高于FCJ組（P＜0.05），說明發酵芹菜汁的抗氧化能力與化學型亞硝酸鹽有一定差距。

2.2.4 調理豬肉餅冰溫貯藏期間生物胺的變化

表1為發酵芹菜汁對調理豬肉餅中生物胺含量的影響。

生物胺廣泛存在于富含蛋白質和氨基酸的食品中[19]，過量攝入會導致人體中毒，造成血管膨脹，導致血壓波動和頭痛、腸部痙攣、腹瀉和嘔吐等[20]，已被歐美國家建議列入肉制品的安全限量攝入[21]。在冰溫貯藏過程中，CK組、FCJ組和NT組的尸胺、精胺均未檢出，NT組亞精胺未檢出。3組調理豬肉餅色胺呈顯著上升趨勢（P＜0.05），貯藏36 d時CK組色胺含量顯著高于其他兩組（P＜0.05）。3組調理豬肉餅中苯乙胺含量變化趨勢大致相同：呈上下波動的趨勢，但是貯藏后期含量均顯著高于貯藏前期（P＜0.05）；腐胺有較強生理毒性，會引起人體痙攣、血壓降低[22]，腐胺存在于所有檢測樣品的所有檢測點中，成為主要的生物胺之一，NT組和FCJ組腐胺在貯藏過程中變化不明顯，CK組貯藏后期有明顯升高的趨勢（P＜0.05）；組胺是生物胺中毒性最強的一類，除CK組貯藏末期組胺含量急劇升高外，其他兩組產品組胺含量變化不顯著（P＞0.05）；酪胺會引起偏頭痛[23]，3組酪胺含量在貯藏后期均高于貯藏前期，特別是CK組，貯藏36 d時的含量是0 d的5.85倍；亞精胺只在FCJ組和CK組檢測出來，含量均呈上升趨勢，CK組在36 d達到峰值3.72mg/kg。從整個貯藏過程中生物胺的變化情況看，色胺、苯乙胺、酪胺和亞精胺含量的增加與貯藏時間相關，從質量的百分比來看，色胺、苯乙胺、腐胺和酪胺的變化在生物胺的變化中起著主導作用成為主要的生物胺。3組之間進行比較，貯藏過程中FCJ組和NT組色胺、組胺和酪胺的生成量差異不顯著（P>0.05），FCJ組組胺含量和酪胺含量低于NK組，這可能是發酵劑中所含有的微生物具有降解生物胺的作用，已報道的生物胺降解菌有干酪乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、彎曲乳桿菌、肉葡萄球菌等[24-25]，到底發酵劑中哪一種菌株降解生物胺的能力更強，還有待進一步研究。

表1 調理豬肉餅貯藏期間生物胺的變化Table 1 Changes of biogenic amine value during storage of ready-to-eating pork patty

就生物胺總量而言，總體均呈顯著上升趨勢。CK組生物胺總量高于其他兩組，說明無論是化學試劑型還是天然合成型亞硝酸鹽，都對生物胺的形成起到抑制作用。

2.2.5 調理豬肉餅冰溫貯藏期間色差的變化

表2為調理肉餅貯藏期間色澤的變化，L*值表示亮度，a*值表示紅度，b*值為黃度。

貯藏過程中NT組L*值呈現先上升后下降趨勢，FCJ組和CK組均呈下降趨勢。貯藏后期，3組調理豬肉餅汁液流失加大，L*值降低。3組比較，貯藏前期和中期FCJ組的L*值最高，這可能是調理豬肉餅中添加發酵芹菜汁增強了光線反射的緣故。貯藏后期，3組調理豬肉餅中a*值都呈現降低趨勢，這是由于紅色的氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，MbO2）被氧化為褐色的高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）的緣故。雖然真空包裝能在一定程度上阻隔氧氣，但在貯藏過程中氧氣仍舊會慢慢滲入，加速MbO2的氧化進程。3組比較，FCJ組的a*值最小，這是芹菜汁本身的綠色所致。3組調理豬肉餅的b*值都呈下降趨勢，但是3組比較，差異并不顯著（P＞0.05）。

表2 調理豬肉餅貯藏期間色澤的變化Table 2 Changes of color parameter during storage of ready-to-eating pork patty

3 結論

本試驗確定芹菜汁最佳的發酵條件為接種lyocarni VBM-60型發酵劑，發酵溫度30℃，發酵劑添加量為3.125×104CFU/mL，發酵pH值為6.0且維持恒定的條件下，發酵48 h亞硝酸鹽含量可達到1 357.45 mg/kg。將利用最佳條件發酵獲得的芹菜汁添加到調理豬肉餅中，并與陽性對照組（添加亞硝酸鈉）和陰性對照組（既不添加發酵芹菜汁也不添加亞硝酸鈉）的調理豬肉餅進行比較，發現芹菜汁添加組在亞硝酸鹽殘留量方面表現出了其優越性，并在抗氧化、抑制生物胺生成和感官品質方面可以部分替代化學合成亞硝酸鹽。這為今后替代化學合成型亞硝酸鹽生產綠色腌肉制品研究提供了科學依據。