水力空化對不同熱處理后大豆球蛋白理化和乳化性質的影響

李春枝，任仙娥，楊鋒，黃永春，閆柳娟

（廣西科技大學生物與化學工程學院廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州545006）

大豆蛋白因其良好的功能特性和豐富的營養價值等優點被廣泛應用于食品工業中。大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S）是大豆蛋白的兩種主要組成成分，含量占70%以上，對大豆蛋白營養價值和功能性質起決定性作用[1]。乳化性是大豆蛋白的重要功能特性[2]。乳化性隨著蛋白質構成的不同而產生差異，11S的乳化穩定性較7S差，乳化活性也顯著低于7S[3]。由于蛋白質的理化和結構性質對其乳化性至關重要，很多方法（包括物理、化學和酶法等）都被用來改變蛋白質的理化和結構性質，以提高其乳化性和其他功能性質[4]。

超聲波作為一種有效的物理改性手段，能改變大豆蛋白產品如大豆分離蛋白和大豆濃縮蛋白的理化性質，進而改善其功能性質，得到了國內外學者的廣泛關注[5-8]。如Hu H等[9]研究發現，超聲處理能降低β-伴大豆球蛋白（7S）的濁度和粒徑、增加表面疏水性、溶解性、乳化活性和乳化穩定性。雖然水力空化和超聲空化的方法不同，但它們產生的空化效應是相似的，即在空化過程中空化泡潰滅的瞬間會產生局部極端瞬時高溫、高壓，并伴有強烈的沖擊波、微射流、湍流和高剪切力，同時還可以產生羥基自由基等空化效應[10]。與超聲空化相比，水力空化更節能更適于放大處理[11]。本文前期的研究結果表明[12]基于渦流的水力空化在一定條件下能使大豆分離蛋白的粒徑減小，表面疏水性增加，改善其溶解性、乳化活性、乳化穩定性和起泡性，并且和超聲空化處理相比，處理大體積（2L）時，水力空化對大豆分離蛋白的理化和功能性質的影響更明顯。

蛋白質的物理改性效果在很大程度上與蛋白質種類、濃度、pH值、離子強度、蛋白變性和聚集的程度等有關[9，13-16]，關于水力空化對不同熱處理后大豆球蛋白的改性還未見報道，因此本論文研究基于孔板的水力空化對經過不同熱處理后大豆球蛋白理化和乳化性質的影響，為水力空化在大豆蛋白改性方面的應用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕：大海糧油工業（防城港）有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1-苯胺-8-萘磺酸（1-aniline-8-naphthalene sulfonic acid，ANS）、對苯二甲酸、5，5'二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5′，5-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、福林酚：阿拉丁試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；F97Pro型熒光分光光度計：天津港東科技發展股份有限公司；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；T25高剪切混合乳化機：上海鑫鯊機械設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆球蛋白的制備

參照 Nagano 等[17]的方法，按 1 ∶15（g/mL）料液比將粉碎后過80目篩的脫脂大豆粉與去離子水混合，混合均勻后用2mol/LNaOH溶液將pH值調至8.0，恒溫磁力攪拌2h后在4℃、10 000 g下離心20 min，得上清液，再向上清液中按0.01 mol/L的比例加入NaHSO3，攪拌均勻后用2 mol/L HCl將溶液調節pH值至6.4，放入冰箱（4℃）中冷藏過夜，然后在4℃、6 500 g下離心20 min，沉淀即為大豆球蛋白。用2mol/LNaOH將大豆球蛋白溶液pH值調節至7.0后透析脫鹽（48 h），凍干備用。

1.3.2 水力空化處理大豆球蛋白

將大豆球蛋白配成質量分數為3%的蛋白溶液，室溫（28℃）下磁力攪拌2 h，并將蛋白溶液pH值調至7.0，然后分別在不同的溫度（70、80℃和90℃）下對蛋白溶液水浴加熱30 min，熱處理結束后迅速將蛋白溶液于冰水浴中冷卻至室溫（28℃），制備成不同溫度熱處理的大豆球蛋白溶液。

水力空化裝置為廣西科技大學廣西糖資源綠色加工重點實驗室自制[18]。將經過不同溫度熱處理后的大豆球蛋白溶液倒入水力空化裝置的貯罐中（700 mL），開啟冷凝水，啟動裝置，處理30 min后取樣測定其理化和乳化性質。

1.3.3 內源熒光光譜的測定

將蛋白質樣品稀釋至0.06%，采用F97Pro型熒光分光光度計測定其內源熒光光譜，設置激發波長為290 nm，掃描發射波長范圍為300 nm～400 nm，激發和發射狹縫均為5 nm。

1.3.4 表面疏水性的測定

參考Haskard等[19]的方法，以ANS為熒光探針，用0.2 mol/L pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液將蛋白質樣品稀釋至不同濃度（0.005 mg/mL～0.5 mg/mL），取 10 μL 8 mmol/L的ANS溶液加入4 mL稀釋后的樣品中，使用熒光分光光度計在設定激發波長為370 nm，發射波長470 nm，狹縫寬為5 nm的條件下測定熒光強度，以熒光強度對蛋白質濃度（mg/mL）的初始斜率（線性回歸分析計算）作為表面疏水性（H0）的指標。

1.3.5 暴露巰基含量的測定

參考Yin等[20]的方法并稍加改動，取2 mL樣品加入5 mL測試液（pH 8.0的Tris-甘氨酸緩沖液），添加100 μL DTNB 溶液（4 mg/mL），在 25℃恒溫搖床中振蕩1 h后，于10 000 r/min下離心10 min，得到上清液，以2 mL蒸餾水加5 mL測試液及100 μL DTNB為空白對照，然后在412 nm處測吸光度值。按下式計算：

式中：A412為412 nm處的吸光度值；C為蛋白質濃度，mg/mL；D為稀釋倍數；73.53為106/（1.36×104），1.36×104為摩爾消光系數。

1.3.6 二硫鍵含量的測定

根據Petruccelli等[21]的方法進行了2-硝基-5-硫代苯磺酸鹽（2-nitro-5-thiosulfobenzoate，NTSB）溶液的配制和二硫鍵含量的測定。0.1 g DTNB分散于10 mL 1 mol/L Na2SO3溶液中，調節反應液pH值至7.5，添加50 μL 0.1 mol/L CuSO4的氨溶液，反應在38℃進行。通過412 nm吸光度值來監控反應液中殘余的NTSB含量的變化，當超過99%的DTNB轉化成NTSB后，終止反應。NTSB儲液在-20℃下保存備用。用新配置的0.2 mol/L Tri-base緩沖液（含0.1 mol/L Na2SO3，10 mmol/L EDTA和3 mol/L異硫酸胍）和NTSB按體積比1∶100混合后調節pH值至9.5配制NTSB測試液。先將3%的蛋白質溶液稀釋3倍，再取350 μL蛋白質樣品至5 mL NTSB測試液中，避光靜置20 min，在412 nm處測吸光度值。

式中：A412為412 nm處的吸光度值；C為蛋白質濃度，mg/mL；D為稀釋倍數；73.53為106/（1.36×104），1.36×104為摩爾消光系數。

1.3.7 溶解性的測定

取經水力空化處理后的蛋白質溶液于10 000 r/min下離心10 min，上清液經適度稀釋后，以牛血清蛋白為標準，采用Lowry法[22]測定稀釋后上清液中蛋白質含量。蛋白質的溶解性表示為上清液中蛋白質含量與樣品中總蛋白質含量的比值。溶解性按下式計算：

1.3.8 乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性（emulsifying stability index，ESI）指數的測定

參照Pearce等[23]的方法并稍作修改來測定EAI和ESI。經水力空化后的蛋白質溶液稀釋10倍后，取稀釋液15 mL緩慢加入5 mL玉米油，在高剪切混合乳化機中以10 000 r/min的轉速剪切乳化1 min后，立刻將剪切結束10 min后從底部吸取的50 μL乳濁液加入到5 mL 0.1%的SDS中，于500 nm處測定吸光值。

EAI和ESI的值按下式計算：

式中：θ為形成乳狀液的油所占的比例，本試驗中為5/20=0.25；C為初始蛋白質濃度，mg/mL；L為比色杯厚度，1 cm；DF為稀釋倍數；A0為0 min時取樣測定的吸光度；A10為10 min時取樣測定的吸光度。

1.4 數據處理

每個試驗均重復3次，結果表示為平均值±標準差，采用SPSS Statistics 19.0軟件對數據進行統計分析，采用LSD和Duncan進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，相關性分析采用Pearson分析。

2 結果與分析

2.1 內源熒光光譜

蛋白質的發射熒光光譜主要由色氨酸（Trp）的環境極性決定，色氨酸是表征蛋白質構象的一種有效手段，因此可以通過色氨酸表征用于評價蛋白質三級結構的變化[24]。水力空化對大豆球蛋白內源熒光光譜的影響見圖1。

圖1 水力空化對大豆球蛋白內源熒光光譜的影響Fig.1 Effect of hydrodynamic cavitation on intrinsic emission fluorescence spectra of soybean globulin

由圖1可以看出，熱處理后，大豆球蛋白的內源熒光光譜最大吸收峰（λmax）均向長波的方向發生了不同程度的位移（紅移），且隨著溫度的增加，λmax位移的程度不斷增加，3種溫度熱處理后λmax可分別由341.6 nm處移到341.8、344.8 nm和347.2 nm處。這說明大豆球蛋白結構發生改變，色氨酸殘基暴露于更極性的微環境中。黃友如等[25]研究高溫處理對從脫脂豆粕中提取的大豆分離蛋白結構的影響時得到了相同的結論，經過40、50、60℃處理后樣品的λmax紅移。在這種情況下，熒光強度的降低可以具體歸因于暴露的色氨酸色團的分子間疏水相互作用的增加[16]，這與熱處理導致蛋白質聚集的事實是一致的，在更高的溫度下聚集程度更高。

由圖1還可以看出，經過水力空化處理后，3種蛋白質樣品的λmax均向短波的方向發生了不同程度的位移（藍移），且位移的程度和樣品熱處理的溫度有關，熱處理的溫度越高，經水力空化后，藍移的程度越大。前期的研究結果發現[18]，未經過熱處理的蛋白質在水力空化處理后，λmax紅移，這說明水力空化對大豆球蛋白λmax的影響和蛋白質初始狀態有關。3種樣品經水力空化后λmax藍移說明蛋白質發生聚集，色氨酸殘基處于更加疏水的環境中，藍移現象也可能是水力空化誘導了熱處理后大豆球蛋白中變性蛋白的構象重排。另一方面，可以看出經水力空化處理后，熒光強度增加，這說明水力空化降低了色氨酸發色團與溶劑或蛋白質中猝滅劑的相互作用。

2.2 表面疏水性

蛋白質表面疏水性大小取決于蛋白質分子與極性水環境接觸后表面疏水性基團的含量，與功能性質密切相關[9]。水力空化對大豆球蛋白表面疏水性的影響見圖2。

圖2 水力空化對大豆球蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of hydrodynamic cavitation on surface hydrophobicity of soybean globulin

由圖2可以看出，70℃下熱處理，大豆球蛋表面疏水性增加不明顯（P>0.05），隨著熱處理溫度的升高，大豆球蛋白的表面疏水性不斷增加。90℃下熱處理能使大豆球蛋白表面疏水性從1 076.5±51.7增加到5 488.7±264.7，是未加熱時的 5 倍多。Tang等[26]和王中江[27]研究發現熱處理能顯著提高大豆分離蛋白表面疏水性。表面疏水性增加的原因是熱誘導的蛋白質展開、變性，使最初埋藏在蛋白質內部的疏水結構域暴露于分子表面。70℃熱處理后大豆球蛋白表面疏水性變化不明顯和大豆球蛋白變性溫度（約80℃）有關，在較低的溫度下，蛋白質分子展開不明顯，暴露出來的疏水性基團數量較少，所以70℃熱處理后大豆球蛋白表面疏水性增加并不明顯。

由圖2還可以看出，經水力空化處理30 min后，70℃熱處理后的蛋白質，表面疏水性顯著增加（P＜0.05），可由 1 128.55±59.89 增加到 1 555.3±56.28，而80℃和90℃熱處理的蛋白質表面疏水性均顯著降低（P＜0.05），90℃熱處理的蛋白質經水力空化30 min后表面疏水性可由5 488.7±264.7降低到4 568.1±180.2。這一現象說明水力空化對蛋白質的影響與蛋白質本身的狀態有關。李楊等[13]研究發現11S球蛋白受射流空化腔體內的空化場、射流場、高壓場、高溫場等多重物理場的作用，導致蛋白質結構展開，內部包裹的疏水性基團暴露，表面疏水性提高，5%的蛋白質溶液經空化處理6 min后，表面疏水性可提高2倍多。前期的研究[28]也發現，經渦流空化處理后，大豆分離蛋白表面疏水性顯著增加。本研究中70℃熱處理后的大豆球蛋白經水力空化處理表面疏水性增加，說明蛋白質分子展開和疏水性基團暴露。而經過80℃和90℃熱處理的蛋白質表面疏水性發生不同變化，原因在于，在蛋白質分子變性溫度附近，高溫已經使蛋白質分子展開，再經過水力空化處理，瞬時高溫、高壓、高剪切力、沖擊波、微射流及湍流等空化效應使蛋白質分子運動加劇，在疏水相互作用下發生聚集，使暴露出來的疏水基團重新掩埋在分子內部，導致表面疏水性降低。

2.3 暴露巰基和二硫鍵含量

巰基和二硫鍵維持著蛋白質的結構，對蛋白質的功能性質有著重要的意義。水力空化對大豆球蛋白暴露巰基和二硫鍵的影響分別見圖3A和圖3B。

圖3 水力空化對大豆球蛋白暴露巰基和二硫鍵含量的影響Fig.3 Effect of hydrodynamic cavitation on the exposed SH and SS contents of soybean globulin

由圖3A可以看出，未處理的大豆球蛋白暴露巰基和二硫鍵含量分別為（5.20±0.01）μmol/g和（42.64±0.23）μmol/g。熱處理導致暴露巰基和二硫鍵的含量發生變化，但是變化的程度與熱處理溫度有關。70℃熱處理使暴露巰基含量降低但并不明顯（P>0.05），80℃和90℃熱處理使暴露巰基含量增加。陶汝青等[29]和馬丹等[30]研究發現隨著熱處理溫度增加，大豆分離蛋白暴露巰基含量不斷增加。暴露巰基含量增加的原因一方面是熱處理使蛋白質結構展開，部分掩埋的巰基暴露出來；另一方面，熱處理使二硫鍵含量降低（圖3B），二硫鍵和巰基的相互轉變也會導致暴露巰基含量增加。

由圖3還可以看出，經水力空化處理后，所有樣品暴露巰基含量均顯著降低（P＜0.05），可分別由（5.11±0.06）、（5.56±0.25）μmol/g 和（6.89±0.23）μmol/g降低到（4.59±0.05）、（5.08±0.23）μmol/g 和（5.89±0.16）μmol/g。與此同時空化產生的極端高溫、高壓、高剪切力和湍流等作用會使二硫鍵斷裂，二硫鍵的含量顯著降低（P＜0.05）（見圖3B），所以游離巰基含量的降低并不是由巰基和二硫鍵含量相互轉化引起的。另外，由圖1和圖2可以看出，水力空化會誘導蛋白質聚集體的形成，導致暴露巰基被重新掩埋在分子內部。另一方面，值得注意的是水力空化一個重要的空化效應是水分子斷裂產生·H和·OH，·OH具有強氧化性，可以將巰基氧化成次磺酸或磺酸基，導致巰基含量降低[28]。

2.4 溶解性

蛋白質溶解性是決定蛋白質功能性質的重要因素，一般認為，溶解性良好的蛋白質往往具有較好的功能性質，如凝膠性、起泡性和乳化性等[31]。大豆蛋白經熱處理后會在一定程度上形成可溶性或不溶性的聚集體，使其溶解性發生變化[32]。水力空化對大豆球蛋白溶解性的影響見圖4。

由圖4可以看出，未經過處理的大豆球蛋白表現出良好的溶解性（93.08±2.53）%，經過不同溫度的熱處理后，大豆球蛋白溶解性均降低，高于11S熱變性溫度（約80℃）處理明顯降低了溶解性（P＜0.05），90℃熱處理下可使大豆球蛋白溶解性降低10.55%。說明熱處理產生了不溶性聚集體。

由圖4還可以看出，水力空化處理使大豆球蛋白的溶解性顯著降低（P＜0.05），其原因可能是水力空化產生的瞬時高溫、高壓、高剪切力、沖擊波、微射流及湍流等空化效應使大豆球蛋白分子運動加劇，通過疏水相互作用形成聚集體導致大豆球蛋白溶解性降低，而水分子斷裂產生的強氧化自由基（·OH）對大豆球蛋白的氧化作用可能是大豆球蛋白溶解性降低的另一原因。前期的研究發現[28]渦流空化處理大豆分離蛋白，可以有效地改善其溶解性，與本試驗研究相反。這可能與水力空化產生的方式與所處理樣品的不同有關系。

圖4 水力空化對大豆球蛋白溶解性的影響Fig.4 Effect of hydrodynamic cavitation on solubility of soybean globulin

2.5 乳化活性和乳化穩定性

乳化活性（EAI）由最初形成的乳液在稀釋的SDS溶液中的渾濁度決定，通常代表了蛋白質幫助油相分散到水相的能力[16]，乳化穩定性（ESI）表示乳液保持穩定狀態的能力，ESI越高，表示乳化性質越優[33]。水力空化對大豆球蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響分別見圖5A和圖5B。

由圖5A可以看出不同溫度處理會導致大豆球蛋白乳化活性發生不同的變化，經70℃熱處理后，大豆球蛋白乳化活性顯著降低，而再繼續增加處理溫度大豆球蛋白乳化活性反而顯著增加。有研究證明溶解性和表面疏水性對蛋白質的乳化性能非常重要[32，34]，經熱處理后，大豆球蛋白結構的展開（圖1）和疏水性基團的暴露（圖2）使蛋白質具有更好的吸附油水界面的潛力，使蛋白質乳化活性增加，經70℃熱處理后，大豆球蛋白表面疏水性增加并不明顯，與此同時經過熱處理后，大豆球蛋白溶解性降低，這可能是導致大豆球蛋白乳化活性降低的原因。

經水力空化處理后，不同溫度熱再處理的蛋白質表現出不同的變化趨勢，70℃熱處理再經水力空化處理后大豆球蛋白乳化活性有輕微的增加，由（8.63±0.35）m2/g增加到（9.35±0.37）m2/g，而經過 80℃和 90℃熱處理的大豆球蛋白經水力空化后乳化活性反而顯著降低，可見水力空化在一定條件下能改善大豆球蛋白的乳化活性。經水力空化處理后大豆球蛋白表面疏水性降低（圖2）且溶解性降低（圖4）是導致經過80℃和90℃熱處理大豆球蛋白乳化活性降低的原因，而在70℃熱處理的蛋白經水力空化處理后表面疏水性顯著增加（由 128.55±59.89增加到 1 555.3±56.28）是導致大豆球蛋白乳化活性增加的原因。

圖5 水力空化對大豆球蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.5 Effect of hydrodynamic cavitation on emulsion activity and emulsion stability of soybean globulin

由圖5還可以看出，大豆球蛋白熱處理溫度越高乳化穩定性越差。而經過水力空化處理后，乳化穩定性均顯著增加，增加的趨勢和熱處理溫度有關，熱處理溫度越高，增加趨勢越緩慢。70℃熱處理后的蛋白質經水力空化處理后乳化穩定性可由（39.78±1.22）min增加到（103.1±0.64）min?？梢娝栈幚碓谝欢l件下能夠有效改善大豆球蛋白的乳化穩定性。

3 結論

不同溫度熱處理后的大豆球蛋白經水力空化處理后，內源熒光光譜最大吸收峰藍移，暴露巰基含量、二硫鍵含量和溶解性均降低，乳化穩定性增加，其中70℃熱處理后的大豆球蛋白乳化穩定性可由（39.78±1.22）min增加到（103.1±0.64）min。70℃熱處理后的大豆球蛋白表面疏水性和乳化活性增加，而80℃和90℃熱處理后的大豆球蛋白表面疏水性和乳化活性均降低?？梢?，水力空化在一定條件下能誘導大豆球蛋白的理化性質發生變化，從而改善其乳化穩定性。關于水力空化在不同pH值和不同離子條件下對大豆球蛋白理化和功能性質的影響有待下一步研究。