不同水解度對核桃分離蛋白酶解物功能特性的影響

劉猛，史婷

（1.呂梁學院生命科學系，山西呂梁033000；2.山西省特色植物功能成分工程研究中心，山西呂梁033000）

核桃富含礦物質元素、維生素、膳食纖維以及各種營養成分和功能性成分[1]。其油脂中含有大量不飽和脂肪酸[2]，尤其含有很多對身體有益的油酸和亞油酸，也可能含有抗食道癌及中和鉛中毒的物質[3-4]。核桃蛋白濃縮物和分離物可作為潛在的功能性食品成分[5]。近年來，我國核桃產量增加，2011年我國核桃年產量約為342萬噸，2017年我國核桃年產量約365萬噸[6-7]。以前核桃餅粕利用率很低，現在核桃副產物逐漸被開發成產品。比如核桃殼制備的活性炭、核桃粕制備的蛋白粉[8]。核桃粕生化性質和物理性質也被廣泛研究。經研究，核桃餅粕的干物質、粗脂肪、粗纖維和非植酸磷常規營養成分含量較高，粗蛋白含量與大豆餅粕等同類飼料相當。維生素B1、維生素B6、錳及精氨酸等微量營養成分含量比大豆餅粕高[9]。

有研究證實了核桃蛋白經過酶水解以后，其溶解性、乳化性、起泡性等功能特性有了很大的變化，經酶修飾的蛋白可應用于生產[10]。Paz-Yépez等研究了顆粒大小和腸道條件對核桃和花生體外脂質和蛋白質消化的影響。結果表明，堅果顆粒大小對蛋白質水解和分析基質降解指數的影響最大。有研究也探究了不同水解度對大豆和花生分離蛋白的影響[11-12]，表明隨著水解度的增大，大豆蛋白持水性和最終黏度值降低，溶解性顯著性增大；花生蛋白熱穩定性、溶解度和成膠能力提高，蛋白品質得到提升[13-14]。不同油脂提取方法對核桃粉蛋白特性有影響，核桃分離蛋白功能特性因受到壓力而發生改變[15]。核桃仁蛋白酶解物可應用于釀造，提高發酵性能。大豆天然蛋白的持水性很低，需要改性以提高持水性，使之應用于食品加工中，來改善肉制品產品質量[16]。這些研究說明了探究水解度對于核桃分離蛋白酶解物持水性、乳化性、乳化穩定性、起泡性、泡沫穩定性的影響有一定的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010S型）：上海碧云天生物技術有限公司；色拉油：市售；堿性蛋白酶（酶活1×105U/g）：河南安銳生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S型）：北京海天友誠儀器廠；離心機（SC-04型）：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；酶標儀（EPOCH2型）：美國伯騰儀器有限公司；電子天平（FA2104S）：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃分離蛋白的制備

用電子天平稱取200 g核桃餅粕，按照料液比1∶10（g/mL）的比例，加蒸餾水2 000 mL，混勻后利用酸沉堿提[17-18]的原理用1 mol/L氫氧化鈉滴定pH值至9.0，在超聲回流裝置中，50℃下提取1 h，之后放置30 min，置于離心機中3 000 r/min下離心20 min，結束后取出上清液，用1 mol/L鹽酸緩慢調其pH值至4.5，再次放入離心機3 000 r/min離心20 min，取出沉淀層，加蒸餾水調節pH值至中性，放入離心機3 000 r/min離心20 min，離心管里的下層即為分離蛋白溶液。最后用BCA蛋白濃度測定試劑盒于酶標儀中測定后，處理數據得到核桃分離蛋白的濃度。

1.3.2 不同水解度核桃分離蛋白的制備

選擇堿性蛋白酶對分離蛋白進行酶解，堿性蛋白酶酶解核桃餅粕分離蛋白的最優酶解條件：底物濃度為 5.0%[分離蛋白 ∶水=1 ∶20（g/mL）]，酶解 pH 9，酶加入量 5 000 U/g，溫度 55 ℃[19]。分別酶解 20、40、60、80、100、120、140、160 min。同時做一組空白對照試驗，在酶解過程中，滴入0.5 mol/L NaOH溶液，反應液的pH值為恒定值9.0時停止滴入NaOH溶液。之后，將酶解液放入100°C水中滅酶15 min，冷卻后，調節pH值至7.0，4 000 r/min離心5 min，上清液為酶解后產物。

1.3.3 水解度的測定

水解度采用pH-stat法[20-21]進行測定，根據水解過程中的0.5 mol/L NaOH（標定）的消耗量來計算水解程度。每20 min記錄一次NaOH的消耗體積，直到完成所需水解過程，然后對此水解溶液進行高溫滅酶處理，記錄滴定過程使用的NaOH溶液的總量。

水解度（degree of hydrolysis，DH）的計算如公式（1）所示：

式中：B為水解過程完成時NaOH溶液消耗量，mL；Nb為標定的 NaOH 溶液實際濃度，mol/L；Mp為需要水解的核桃蛋白質量，g；htot為核桃蛋白中肽鍵的總數，取8.0 mmol/g；α為蛋白氨基的平均解離度，通常取數值7。

1.3.4 持水性的測定

取28.7 mL酶解產物，放入10 mL水中，勻速攪拌直至混合，放在恒溫磁力攪動器中，調至溫度50°C保溫30 min。把上述溶液緩慢移入到確定質量的離心管中，4 500 r/min離心20 min，把上面一層液體移除之后，稱出離心管與沉淀質量。

持水性（water holding capacity，WHC）的計算如公式（2）所示：

式中：M為樣品質量，g；M1為離心管和沉淀物的總質量，g；M2為離心管和樣品的總質量，g。

1.3.5 乳化性及乳化穩定性的測定

取28.7 mL酶解液，緩慢倒入40 mL水，再取40mL色拉油放入其中，在4 500 r/min下均質2 min，完成后，再將液體倒入離心管1 500 r/min離心15 min。測出離心管中乳化層高度和液體的高度，兩者之比即為乳化性。

把以上液體放入90℃恒定溫度水中靜置30 min，然后降溫冷卻，15 000 r/min離心15 min，再次量出乳化層的高度。水浴后離心管中乳化層高度與初始乳化層高度之比即為乳化穩定性。

1.3.6 起泡性及泡沫穩定性的測定

取28.7mL酶解液，加入100mL蒸餾水，4000r/min均質2 min，測量泡沫總體積，此時的泡沫體積與100之比即為起泡性。然后靜置樣品30 min，再一次測量泡沫的總體積[22]。靜置后的泡沫體積與均質停止時的泡沫體積之比即為泡沫穩定性。

1.4 統計學分析及繪圖

數據采用Origin9.1軟件進行計算繪圖。采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。數據以±s表示，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 蛋白濃度的測定

蛋白質濃度標準曲線如圖1所示。

圖1 BCA法測定蛋白質濃度標準曲線Fig.1 Standard curve of protein concentration determined by BCA method

以蛋白質濃度為橫坐標，OD562為縱坐標，建立標準曲線的回歸方程為y=0.897 37x+0.078 46（R2=0.996 78），由標準曲線得到分離蛋白樣品中蛋白質濃度為34.8 mg/mL。

2.2 水解度的測定

核桃分離蛋白水解時間與水解度的關系如圖2所示。

圖2 核桃分離蛋白水解時間與水解度的關系Fig.2 The relationship between hydrolysis time and hydrolysis degree of walnut protein isolate

由圖2可知，運用pH-stat法測定核桃粕蛋白的水解度，用堿性蛋白酶酶解核桃餅粕蛋白質，在前80 min時，水解速度較快，隨著時間的延長，水解度增長速度變緩；當酶水解時間達到120 min時，達到最高值，此時為19.4%，此后時間延長，其水解度不再變化。即120 min為最大酶解程度所需的最短時間。由于在120 min以后水解度未發生改變，20 min和40 min對應的水解度無顯著性差異，100 min和120 min對應的水解度無顯著性差異，因此綜合考慮之后，選取了 0、40、80、120 min 4個梯度進行功能性質的測定。

2.3 持水性的測定

不同水解度的核桃分離蛋白持水性如圖3所示。

圖3 核桃分離蛋白水解時間與持水性的關系Fig.3 The relationship between hydrolysis time of walnut protein isolate and water retention

由圖3可知，酶解時間0～120 min，核桃分離蛋白的持水性呈現先增大后減小的趨勢。酶解0～80 min，隨著水解時間的延長，水解度逐漸增大，酶解80min時，分離蛋白持水性最佳。酶解時間超過80 min，持水性反而會下降。這是因為核桃蛋白經過蛋白酶水解，逐漸水解為低分子量的多肽，導致多肽鏈伸展、空間結構發生變化，持水性提高。當水解度過大時，多肽段變得很小，極易溶解于水中，不利于形成蛋白質的網狀結構，持水性下降[12，23]。因此，持水性與水解度有一定的關系，持水性受多肽溶解的影響而變小。

2.4 乳化性及乳化穩定性的測定

不同水解度的核桃分離蛋白乳化性及乳化穩定性如圖4所示。

由圖4分析得出，酶解0～80 min，隨著水解時間的增加，乳化性一直上升。酶解時間80 min～120 min，隨著酶解程度的增大，乳化性卻表現出下降的趨勢。在一定的水解度下，核桃分離蛋白經酶解后，變為小分子，其中一些露在外的親油基團使其對油脂分子的吸收能力變大，溶液中的氨基酸迅速轉移到油和水的界面上，促進乳濁體系的形成，才會導致乳化性增強。后期隨著水解度持續增大，蛋白水解超過極限，由于此時過度水解導致蛋白質的內部遭到破壞，與脂質分子的組合能力降低，乳化性下降。

圖4 核桃分離蛋白的水解時間與乳化性、乳化穩定性的關系Fig.4 The relationship between hydrolysis time of walnut protein isolate and emulsification property and stability

酶解0～120 min乳化穩定性隨水解度的增大而一直升高，且開始上升趨勢較緩，后來上升趨勢較快。這是因為親油基團對油脂分子形成了一定的屏障作用，乳化穩定性隨著水解度的變大而增強，即趨勢一致成正比。另外，由于受分子溶解性的作用，形成了界面膜以增強小分子的乳化穩定性。此外，又由于蛋白質是帶電的，油分子被靜電作用力吸到一側阻礙了運動，從而提高了乳化穩定性。

2.5 起泡性及泡沫穩定性的測定

不同水解度的核桃分離蛋白起泡性及泡沫穩定性如圖5所示。

圖5 核桃分離蛋白水解時間與起泡性及泡沫穩定性的關系Fig.5 The relationship between hydrolysis time of walnut protein isolate and foaming property and foam stability

由圖5可知，核桃分離蛋白的起泡性在酶解0～120 min內，隨水解時間的延長，一直呈增大的趨勢。未進行酶解時，蛋白質起泡性最小，為40.0%，在120 min時起泡性達到最大值為85.0%。說明隨著核桃分離蛋白水解度的增大，酶解產物的起泡性逐漸增大。當水解時間大于80 min，起泡性增長速度變快，這是因為酶解后，蛋白質分子的各條肽鏈舒展開來，通過分子之間的作用力使膜形成，此時酶解使分子之間的空間結構展開，親脂性基團露出，將空氣包埋在水中，液泡表面張力減小，氣泡穩定性隨之變大，促進表面膜形成后，蛋白的起泡性得以增大。

隨著酶解時間的延長，核桃分離蛋白水解產物的泡沫穩定性逐漸減小，這是因為高度酶解后使產物中形成較多的小分子多肽，疏水基團暴露在外導致小的那一部分肽鏈無法使液體膜達到穩定，穩定性開始下降，也有一部分原因是隨著酶解的逐步進行，電荷有所增加，蛋白質分子在氣液表面的吸附作用被阻礙，從而降低了泡沫穩定性。

3 結論

將核桃餅粕用堿性蛋白酶水解，通過改變酶解的時間制成不同水解度的分離蛋白，研究水解度對其功能特性的影響。經研究得出，水解度可提高也可削弱某些功能特性。在酶解0～120 min內，起泡性及乳化穩定性隨酶解程度增大而變大，持水性及乳化性隨酶解程度的增大呈現先增大后減小的趨向，在中間的某個水解度達到最大值。泡沫穩定性隨酶解程度增大而變小。