小標本二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細胞

胡天星 余南嵐 楊海潮 朱琳 楊希川

陸軍軍醫大學第一附屬醫院皮膚科，重慶400038

毛乳頭是位于毛囊基底部的特殊間質成分，在毛囊發育和周期性再生調控中起主導作用，毛乳頭細胞功能異常是導致毛囊周期失衡和脫發的主要起始因素［1?2］。因此，體外培養毛乳頭細胞是深入研究毛囊生物學和各種與毛發相關的功能代謝疾病的關鍵環節和基礎［3?4］。但頭皮標本獲取困難，同時毛乳頭位置隱蔽，分離與培養困難，嚴重限制了毛囊生物學的研究和發展。我們改良建立了一種簡單、高效、易操作且高質量分離和培養小標本人頭皮毛乳頭細胞的方法，為進一步研究毛囊生物學提供細胞來源支持。

一、材料

1. 主要試劑：胎牛血清（德國PAN?Biotech 公司），DMEM/高糖培養基、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone 公司），0.6%分離酶Ⅱ、0.2%膠原酶Ⅳ（美國Sigma?Aldrich公司），一抗鼠抗人層黏連蛋白單克隆抗體、Ⅳ型膠原多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司），牛血清白蛋白（美國Genview公司），二抗3H-吲哚菁類染料標記的羊抗鼠IgG 抗體、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液、二甲基亞砜（上海碧云天生物技術有限公司）、青-鏈霉素溶液（以色列Biological Industries公司）。全培養基由10 ml血清、1 ml青-鏈霉素溶液、98 ml DMEM/高糖培養基配制。

2.標本來源和保存：2018 年9 月至2019 年1 月在陸軍軍醫大學第一附屬醫院皮膚科收集3例頭部色素痣、6例皮脂腺痣切除術廢棄的含毛皮膚標本。其中，1例皮脂腺痣位于輕度雄激素性禿發區，標本大小為0.5 cm × 0.5 cm ～0.5 cm×1 cm。標本采集后立即置4 ℃無菌生理氯化鈉溶液中保存，保存時間<12 h。所有標本采用小標本二步酶消化法分離毛乳頭，1例色素痣和1例皮脂腺痣標本同時還采用一步酶消化法進行處理。本研究經解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院倫理委員會批準（倫理審批號KY201977）。

二、方法

1. 標本消毒：在無菌培養皿中用75%乙醇浸泡標本3 遍，每次3 min，4 ℃無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3 次后，移入裝有PBS的無菌培養皿中。

2.小標本二步酶消化法分離毛乳頭：①用鑷子夾住標本，脂肪面朝上，用眼科剪盡量去除多余皮下脂肪組織，直至顯露毛球部，剪下毛根部，置4 ℃無菌PBS中；②用鑷子從毛根部分離出單個含毛球部的毛囊，轉入含0.6%分離酶Ⅱ的培養皿中，37 ℃消化30 min，待毛干從結締組織層分離出（圖1A）；③去除培養皿中的分離酶，加0.2%膠原酶37 ℃消化30 ～60 min，此后每20 min 觀察毛乳頭游離情況，當包裹毛乳頭的結締組織層開始松散，毛乳頭快要游離時立即加入3 倍體積的全培養基終止消化；④反復緩慢吹打3 ～5 次培養基，使毛乳頭從結締組織中釋放出來，離心（1 000 r/min，5 min，離心半徑15.5 cm，下同）、棄上清液，沉淀為毛乳頭、毛干、結締組織等混合物，用1 ml 全培養基重懸沉淀物并移入培養皿中，加3 ml DMEM/高糖培養基反復緩慢沖洗，用移液槍去除懸浮的毛干、殘發及部分可見纖維組織；⑤繼續低速離心（500 r/min，5 min）3次、棄上清液，用1 ml全培養基重懸沉淀物，移入無菌60 mm培養皿中，補齊3 ml全培養基，37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

一步酶消化法：參考文獻［5］的方法分離。

3.毛乳頭細胞培養：將分離獲得的毛乳頭用全培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。12 h后首次觀察毛乳頭貼壁情況，此后每12 h 觀察1 次。當所有貼壁的毛乳頭開始遷出，進行第1 次半量換液，此后每隔24 h 半量換液1 次。計算毛乳頭分離率（分離毛乳頭數/毛囊數×100%）、貼壁率（貼壁毛乳頭數/分離毛乳頭數×100%），記錄毛乳頭細胞遷出時間。

待細胞完全遷出后重懸，去除原培養基，加0.25%胰蛋白酶1.5 ml，37 ℃消化1 min，鏡檢可見毛乳頭邊緣部細胞變圓，中心部細胞趨于圓形，鏡下室溫消化1 ～2 min，待中心部大部分細胞變圓后，去除胰蛋白酶，立刻加入1 ml全培養基終止消化，吹打細胞至完全脫落形成單細胞并均勻分布在培養基中，補齊3 ml全培養基，繼續于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養，即為原代毛乳頭細胞。

4.毛乳頭細胞傳代：將原代毛乳頭細胞重懸后培養，融合約90%后及時進行傳代，去除原培養基，加0.25%胰蛋白酶1.5 ml，37 ℃消化1 min，鏡檢可見部分細胞開始變圓，鏡下室溫消化1 ～2 min，待80%細胞變圓后，立刻加入1 ml全培養基終止消化，用移液器吹打細胞至完全重懸，移入無菌離心管離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加2 ml 培養基重懸，按1∶2比例傳代，補齊3 ml全培養基，繼續放入37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養，即為第1代毛乳頭細胞。

5. 毛乳頭細胞的鑒定：取第3 代毛乳頭細胞，按每皿1 ×105個接種到激光共聚焦小皿上，37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養過夜，細胞密度約70%時，4%多聚甲醛室溫固定20 min。PBS 漂洗3 次，0.5% Triton X?100 室溫通透20 min，PBS漂洗3次，每次5 min。5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，棄封閉液加入一抗4 ℃過夜。PBS漂洗3次，每次5 min，加二抗室溫避光孵育30 min，PBS 漂洗3 次，每次10 min，DAPI 復染核，95%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

6.毛乳頭細胞凍存：取第3 ～4代處于對數生長期的毛乳頭細胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集于離心管中離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加900 μl胎牛血清重懸，緩慢加入100 μl 二甲基亞砜移入凍存管，4 ℃放置30 min，-80 ℃過夜，最后于液氮中保存。

7. 毛乳頭細胞復蘇：向15 ml 無菌離心管中加2 ml 全培養基，取凍存細胞，37 ℃水浴融化后轉入離心管離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加1 ml全培養基重懸，移入培養皿中，補齊3 ml 全培養基置37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養，24 h后觀察細胞貼壁生長情況。

三、結果

1.毛乳頭分離：小標本二步酶消化法分離的頭皮毛乳頭鏡下呈倒梨形，形態完整，部分可見殘留真皮鞘（圖1B），毛乳頭分離率為60.8%±2.1%。而一步酶消化法未分離出毛乳頭。毛乳頭細胞分離方法比較見表1。

項目標本大小毛囊處理消化方法收集方法總操作時間實際操作時間毛乳頭分離率（n=77）毛乳頭貼壁率（n=47）一步酶消化法0.5 cm×0.5 cm ～0.5 cm×1 cm剪碎被脂肪包裹的毛囊部0.2%膠原酶Ⅳ37 ℃消化4 ～5 h顯微鏡下拾撿6.0 ～8.0 h 2.0 ～3.0 h小標本二步酶消化法0.5 cm×0.5 cm ～0.5 cm×1 cm剪下整塊毛球部，分離單個毛囊0.6%分離酶Ⅱ37 ℃消化30 min；0.2%膠原酶Ⅳ37 ℃消化30 ～60 min低速離心收集（500 r/min，5 min，離心半徑為15.5 cm）2.0 ～3.0 h 1.0 ～1.5 h 60.8%±2.1%33.7%±7.0%a改良二步酶消化法［6］>0.5 cm×1 cm剪取毛乳頭組織，分離毛囊0.5%分離酶4 ℃消化6 ～8 h；0.2%膠原酶D 37 ℃消化4 h離心收集（2000 r/min，5 min，離心半徑為15.5 cm）≥10.0 h≥2.0 h約40%約30%b 00

2.毛乳頭細胞培養：小標本二步酶消化法分離出的毛乳頭接種12 h 后出現貼壁，24 h 后貼壁的毛乳頭即有大量細胞遷出，剛遷出的細胞呈短梭形（圖1C）；48 h后細胞進一步遷出，細胞質豐富，呈長梭形（圖1D）；60 h后細胞大面積遷出，初步呈聚集生長（圖1E）；72 h后細胞基本遷出完成，隨著細胞大量增殖，靠近毛乳頭中心位置遷出的細胞呈多層聚集生長現象（圖1F）。小標本二步酶消化法毛乳頭細胞12 h 貼壁率為33.7%±7.0%，72 h 貼壁率為86.6%±3.9%，細胞遷出時間0.5 ～3.0 d，實驗總操作時間2.0 ～3.0 h，減去消化等待時間，實際操作時間1.0 ～1.5 h。

3.毛乳頭細胞傳代：用上述方法傳代后，第2代毛乳頭細胞24 h 后即可見細胞貼壁生長，傳代的毛乳頭細胞重新呈凝集性生長趨勢（圖1G）。48 h后凝集性生長愈發明顯。但隨傳代次數的增加，該細胞特有的凝集性生長趨勢會逐漸消失，第9代細胞不再出現凝集性生長現象（圖1H）。

4.免疫熒光鑒定毛乳頭細胞：頭皮毛乳頭細胞同時表達Ⅳ型膠原和細胞層黏連蛋白（圖2）。

5.毛乳頭細胞復蘇：復蘇的細胞狀態良好，48 h后開始呈現明顯的凝集性生長狀態（圖1I）。

四、討論

毛乳頭是位于毛囊基底部特殊的間質成分，具有強烈的蛋白合成與旁分泌特征，毛乳頭細胞具有凝集性生長特性［7］，其最顯著的功能特點是誘導毛囊形成及再生［8］。體外分離培養頭皮毛乳頭細胞是研究毛囊的前提和基礎。然而，頭皮標本來源有限，大多為頭部手術后的廢棄組織，能獲得的標本較小，且單個標本所含毛囊數通常<20個。目前頭皮毛乳頭細胞的分離方法主要包括顯微解剖法和酶消化法。盡管顯微解剖法中毛乳頭獲得率高，但獲得的毛乳頭貼壁率低、細胞遷出慢，且需特殊的體視顯微鏡，對操作人員的技術要求高，勞動強度大，且耗時長、效率低；一步酶消化法簡便、易操作，但標本需求量大，且對毛囊質量要求高［9?10］。毛囊質量與能否成功分離培養毛乳頭細胞有密不可分的關系，毛囊質量與患者年齡、毛發質量及術后廢棄部位均有關［11］。這些因素均限制了人頭皮毛乳頭細胞的分離培養。因此，我們改良建立了小標本二步酶消化法，對分離、培養、保存小標本人頭皮毛乳頭細胞有重要意義。

小標本二步酶消化法操作簡單、高效，0.6%分離酶Ⅱ37 ℃消化30 min 可實現毛乳頭與毛囊上皮在基底膜的分離，0.2%膠原酶Ⅳ37 ℃下作用30 ～60 min可消化毛乳頭周圍的膠原纖維、脂肪組織和結締組織等［12］，在分離酶和膠原酶的交替作用下通過500 r/min低速離心能夠最大限度地將毛乳頭從毛囊中分離出來，減少毛乳頭的損傷和損失。對于毛囊質量不高的雄激素性禿發患者脫發區的毛囊用此方法也能成功分離出毛乳頭，并培養毛乳頭細胞。免疫熒光顯示分離的細胞同時表達Ⅳ型膠原和細胞層黏連蛋白，可鑒定為毛乳頭細胞［6］。與人頭皮毛乳頭細胞的改良二步酶消化法［6］和一步酶消化法［5］相比較，小標本二步酶消化法可明顯縮短毛乳頭分離時間，提高毛乳頭分離率和貼壁率，縮短毛乳頭細胞的遷出時間，提高低質量毛囊分離成功率（表1）。本研究中一步酶消化法未分離出毛乳頭，原因可能是獲取的標本小、毛囊質量差且數量少，初步處理標本的過程中，毛囊可能被破壞。

我們改良建立的小標本人頭皮毛乳頭細胞二步酶消化法既具有顯微解剖法的低毛乳頭損失優點，又具有一步酶消化法操作簡單等特點，同時具備耗時短、對標本要求低等優點，是一種較為理想的小標本分離培養毛乳頭細胞的方法，具有推廣和應用價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突