尼羅羅非魚Galectin-related protein B基因的原核表達與條件優化

黃永雄 牛金中 楊世平 簡紀常

摘 要：Galectin-related protein B是一種缺乏半乳糖苷結合活性的半乳糖凝集素相關蛋白B?；贜CBI公布的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus） Galectin-related protein B 基因序列設計帶酶切位點引物，構建原核表達載體pET-28a-GRPB，將重組質粒導入大腸桿菌，誘導重組質粒的蛋白表達，并對蛋白表達條件進行優化。結果表明：在28℃條件下，IPTG濃度為0.20mmol/L，誘導6h時，誘導重組蛋白的效果最佳;經Western-blot免疫印跡顯示，純化后的重組蛋白能與帶HIS標簽的單抗特異結合，條帶單一，進一步證明該重組蛋白為Galectin-related protein B蛋白。

關鍵詞：尼羅羅非魚;凝集素相關蛋白B;原核表達;條件優化

中圖分類號 S917.4? 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）18-0012-04

Prokaryotic Expression and Condition Optimization of Galectin-related Protein B Gene in Nile Tilapia

HUANG Yongxiong et al.

（Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemilogy for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China;Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang 524088，China）

Abstract：Galectin-related protein B is a galactose lectin-related protein B which lacks galactoside binding activity. In this study，primers with restriction site were designed based on the? Galectin-related protein B gene sequence of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）published by NCBI，and the prokaryotic expression vector pET-28a-GRPB，was constructed. The recombinant plasmid was introduced into E. coli to induce the expression of the recombinant plasmid protein. The factors affecting the expression of the protein were optimized. The results showed that the concentration of the recombinant protein reached a maximum under? the induced time of 6h，the induced temperature of 28℃ and concentration of IPTG of 0.20mmol/L. Western-blot blotting showed that the purified recombinant protein could specifically bind to the monoclonal antibody with HIS tag and had a single band，which further proved that the recombinant protein was Galectin-related protein B protein.

Key words：Oreochromis niloticus;Lectin-associated protein B;Prokaryotic expression;Condition optimization

凝集素是一類碳水化合物結合蛋白，廣泛存在于各種生物體內，能在諸如先天免疫、抵御病原體中發揮作用：識別，內吞，補體激活，抗原加工，B和T細胞克隆選擇、成熟、激活和凋亡[1]。半乳凝素（Galectins）識別β-半乳糖的能力及對凝集素的保守序列2大特征，于20世紀70年代首次被描述為半乳糖苷結合凝集素[2]，也被稱為galaptins和S型凝集素[3]。所有半乳糖凝集素共有130個氨基酸組成的保守碳水化合物識別域（crd），負責碳水化合物的結合。Galectins參與了多種生物過程，如細胞粘附[4]、先天免疫[5-6]、細胞分化與發育[7]、信號轉導[8]，細胞增殖和細胞死亡的調控[9]以及前mRNA剪接[10]。

近年來，人們發現了許多與galectin家族序列相似的蛋白質。然而，由于缺乏半乳糖苷結合活性，它們被稱為Galectin相關蛋白（GRPs）[11]。目前，已從魚類物種中鑒定出若干種GRP，包括紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、綠河鲀（Tetraodon nigroviridis）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）等，但硬骨魚類中，僅報道了條石鯛（Oplegnathus fasciatus）GRP的分子特征和生物學功能[12]。研究顯示，條石鯛GRP是一種進化保守的合成凝集素，與原型半乳糖凝集素密切相關。Galectin相關蛋白在條石鯛的鰓和脾臟中的上調，表明它可能在細菌和病毒感染過程中發揮重要作用。

尼羅羅非魚是我國重要的水產經濟養殖品種[13]，但近年來由于受到無乳鏈球菌感染，羅非魚養殖受到沉重打擊，經濟損失巨大。目前對于羅非魚免疫系統的研究尚處于起步階段，尤其是凝集素相關蛋白。因此，本研究基于Galectin-related protein B基因在NCBI上的序列設計引物克隆其完整ORF區并構建原核表達載體，進行重組蛋白的表達及條件優化，為后續羅非魚凝集素相關蛋白的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所用尼羅羅非魚購于湛江市東海島養殖場;Ex Tap酶、DL2000 DNA Marker、PMD-18載體購于TaKara 生物公司;RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒、切膠回收試劑盒及E.coil DH5α、BL21感受態細胞購自TRANS公司;質粒提取試劑盒由Thermo scientific公司提供;原核表達載體pET-28a（+）載體質粒由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 尼羅羅非魚GRPB基因片段的擴增及測序 在超凈工作臺上剪取羅非魚肝臟組織塊，用組織勻漿器研磨組織塊，按照RNA提取試劑盒說明純化提取RNA。將提取所得RNA用瓊脂凝膠電泳檢測RNA質量，條帶單一且具有2條帶以上即可用RNA反轉錄試劑盒合成cDNA。根據NBCI官網所收錄的羅非魚GRPB基因序列（登錄號：XM_031733405.1）設計克隆引物：GRPB-H-F：CCGGAATTCATGGAAGAAAAGGACAATAAAGAAAATG，GRPB-hisR：CCG CTCGAG A GGCCACCTTGGTAAGCTGTAGA。PCR擴增以合成的cDNA為模板，擴增體系為：Ex Tap：10μL、4-GRPB-H-F/4-GRPB-hisR：1μL、cDNA：1μL、ddH2O：7μL，共20μL。PCR擴增反應程序為：95℃、5min;95℃、30s;56℃、30s;72℃、25s;30個循環;結束后72℃、5min;擴增產物經過凝膠電泳后根據切膠回收試劑盒說明回收產物。將純化所得DNA片段與PMD-18載體鏈接，16℃連接12h后將連接產物導入E.coil DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐抗性的固體培養基中培養，挑選單個菌落進行菌落PCR鑒定，選取陽性菌液送往廣州生工進行測序。

1.2.2 原核表達載體構建 將測序比對結果正確的陽性菌液進行擴增培養提取重組質粒PMD-18-GRPB以及pET-28a（+）空載質粒，分別用EcoR1和XhoI限制內切酶酶切重組質粒和空載質粒，酶切條件為37℃、10min。將酶切產物凝膠電泳，同樣也使用膠回收試劑盒純化回收產物。用T4連接酶將2種回收產物在4℃條件下連接12h后導入BL21感受態細胞，隨后將感受態細胞涂布于含卡那霉素抗性的固體培養基培養，挑選單菌落進行PCR檢測，選取單菌落陽性菌送往生物公司測序。

1.2.3 重組蛋白表達的誘導 將測序比對結果正確的含重組質粒pET-28a-GRPB的單菌落按照1∶100的比例接種于含卡那霉素的液體培養基，在37℃恒溫搖床進行擴大培養，當菌液OD值在0.4～0.6時，加入1mmol/L異丙基硫代半乳糖苷IPTG進行誘導5h，將誘導后菌液離心收集細菌，水煮法提取誘導蛋白，利用聚丙烯酰氨SDS-PAGE凝膠電泳檢測分析蛋白。

1.2.4 重組蛋白表達誘導條件優化（1）IPTG濃度優化。分別使用濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L的IPTG誘導重組蛋白，條件是37℃、5h。收集不同誘導濃度菌液中的細菌，用PBS緩沖液洗去培養液后加蛋白上樣緩沖液染色，水煮10min，4℃離心收集上清進行SDS-PAGE蛋白電泳，分析電泳圖。

（2）誘導溫度優化。溫度設置3個梯度：18、28、37℃，使用1mmol/L IPTG誘導5h，同上述方法步驟處理收集誘導后的蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳，分析圖譜。

（3）誘導時間優化。選取最適IPIG濃度以及誘導溫度，設置誘導時間梯度為1、2、3、4、5、6、7h。分別處理不同誘導時間菌液，進行SDS-PAGE蛋白電泳。

（4）重組蛋白表達形式分析。在最佳誘導條件下誘導重組蛋白，離心收集菌液中細菌，一部分進行超聲波粉碎后，離心取上清和沉淀;另一部分提取全菌蛋白;將上清、沉淀以及全菌蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳，確定重組蛋白主要表達形式。

1.2.5 Western blot分析 將純化所得GRPB蛋白進行SDS-PAGE電泳，完畢后將蛋白轉印到PVDF膜上，轉印電流為450mA，35min。用含5%脫脂奶粉的TBS-Tween-20封閉轉印好的PDVF膜（4℃、2h）。封閉完成后使用TBST緩沖液洗脫PDVF膜，每次洗脫5min，洗脫3次;一抗（含GST標簽鼠抗）常溫孵育GRPB蛋白2h，同樣用TBST 洗脫3次;二抗羊抗鼠IgG常溫孵育蛋白1h，TBST緩沖液洗脫3次，用DAB顯色試劑盒顯色。

2 結果與分析

2.1 GRPB基因的擴增及表達載體的構建 用羅非魚cDNA模板與特異性引物擴增得到一條438bp的條帶（見圖1）。目的片段與PMD-18T載體連接，用PMD-18T載體通用引物M13/RV進行擴增，產物片段大小約560bp（圖1），與預期目標一致，說明所挑選的單菌落為陽性克隆菌，GRPB基因克隆及載體構建成功。

2.2 重組蛋白表達的誘導 重組蛋白pET-28a-GRPB在經IPTG誘導后出現大小約為21kD條帶（圖2），與GRPB蛋白預測大小一致，未經過誘導的重組蛋白則沒有該條帶，而空載pET-28a菌株在誘導前后無差別，說明重組蛋白pET-28a-GRPB表達成功。

2.3 重組蛋白表達誘導條件優化 GRPB蛋白表達量影響后續的蛋白純化和收集，因此，有必要進行IPTG誘導濃度、誘導溫度和誘導時間的優化試驗。由不同濃度IPTG誘導的SDS-PAGE電泳圖可知，在IPTG濃度為0.2mmol/L，重組蛋白的表達量最大（圖3）;誘導時間和誘導濃度不變時，誘導溫度在28℃時蛋白表達量最多（圖4）;蛋白表達量隨誘導時間增加而增多，誘導6h表達量達到最大（圖5）

2.4 GRPB重組蛋白的可溶性分析 分別在18、28、37℃條件下加入0.2mmol/L IPTG誘導GRPB蛋白6h后用超聲波破碎，取上清、沉淀以及全菌跑SDS-PAGE電泳，結果顯示在最優誘導溫度28℃時，GRPB蛋白以可溶性蛋白為主要表達形式（見圖6）。

2.5 GRPB重組蛋白的純化及鑒定 通過最優誘導條件（IPTG濃度為0.2mmol/L、28℃以及誘導6h），經破碎及純化柱純化后跑SDS-PAGE電泳，顯示該蛋白為可溶性蛋白表達且純化后的條帶單一（圖7）。Western-blot結果顯示，GRPB重組蛋白能與鼠抗His-Tag單克隆抗體特異性結合，說明重組蛋白為尼羅羅非魚的Galectin-related protein B蛋白（圖8）。

3 結論與討論

本研究將羅非魚GRPB基因進行克隆及成功構建pET-28a-GRPB原核表達載體，并表達帶HIS標簽蛋白。試驗所用菌株為大腸桿菌，該菌株具有快速、簡易、高效誘導表達等特點[14]，是最為常用的重組蛋白表達體系。蛋白大量純化時，蛋白表達量與溫度、誘導時間及IPTG濃度有關[15]。試驗結果表明，在IPTG濃度為0.2mmol/L，蛋白表達量最大，誘導濃度大于0.2mmol/L時，蛋白表達量反而下降，說明過高濃度的IPTG對大腸桿菌的生長具有抑制作用[16];誘導溫度為28℃時，蛋白表達量最高，誘導溫度過低或過高均對蛋白產量產生影響，推測溫度影響合成蛋白相關酶的活性[17];誘導時間以6h最佳。經Western blot檢測純化后蛋白，蛋白能與帶HIS標簽單克隆抗體特異結合且條帶單一，證明該重組蛋白就是Galectin-related protein B。

本試驗探究了尼羅羅非魚GRPB基因的最優條件誘導原核表達，實現GRPB蛋白的大量純化回收，為后續該基因的抗體制備和蛋白的功能研究奠定了基礎。

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（責編：徐世紅）