亞硝態氮慢性脅迫對凡納濱對蝦體成分和糖代謝的影響*

肖 威 單洪偉 馬 甡 李忠帥

(中國海洋大學 海水養殖教育部重點實驗室 青島 266003)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是我國主要甲殼動物養殖品種之一。2018 年，全國養殖產量為176 萬t，為國內甲殼動物養殖總量的34.2% (國家統計局, 2019)。凡納濱對蝦高密度養殖期間，大量飼料的投入和糞便的排出，使水體中含氮廢物含量不斷提高(寇紅巖等, 2014; Wang et al, 2019)，其在亞硝化細菌的作用下很快轉化成亞硝態氮，但能將亞硝態氮降解的硝化細菌卻生長速度緩慢，最終導致水體中的亞硝態氮大量積累(姚艷玲等, 2018)，在養殖后期，水中的亞硝態氮含量達到20 mg/L (Tseng et al, 2004)。水體中高濃度的NO2–會與Cl–以及其他陰離子爭奪對蝦鰓上的吸收位點(寇紅巖等, 2014; Wang et al, 2016)，通過血液運輸在對蝦體內各部分不斷積累，一部分NO2–還會在對蝦體內轉化成NO3–、尿素和谷氨酸(Tsng et al, 2004)。

亞硝態氮(NO2–-N)脅迫會降低蝦類血藍蛋白載氧能力，是高濃度NO2–-N 對蝦類產生毒性的主要原因(寇紅巖等, 2014)。急性NO2–-N 脅迫會降低蝦類的存活率(Lin et al, 2003; 寇紅巖等, 2014)，破壞蝦類血細胞(郭慧等, 2015)、肝胰腺和鰓等組織結構(呂曉燕等,2010)，降低蝦類機體免疫力(Wang et al, 2004)，增加蝦類對病菌的易感性(黃翔鵠等, 2006; 葛紅星等,2014)，破壞蝦類的正常代謝(Jiang et al, 2014)。研究表明，蝦類長期生活在低濃度NO2–-N 環境中，有利于攝食能轉化為生長能(朱其建等, 2014)，并且在一定范圍內，鹽度越高，蝦類對NO2–-N 耐受能力提高(Sowers et al, 2004; Furtado et al, 2016)。規格為10 cm的凡納濱對蝦在鹽度17 和31 的海水中，NO2–-N 安全濃度分別為4.0 和8.9 mg/L(黃翔鵠等, 2006)。但目前關于NO2–-N 慢性脅迫對蝦類影響的資料較少。

Ulaje 等(2019)研究表明，凡納濱對蝦應對環境脅迫會加快糖類的動員和儲存。本研究關注凡納濱對蝦在NO2–-N 慢性脅迫下的存活率、生長情況、體成分、糖酵解和無氧代謝途徑的變化，以期為凡納濱對蝦健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗用蝦

實驗所用的凡納濱對蝦購自山東省威海文登泰裕水產良種繁育有限公司。凡納濱對蝦初始體長為(5.71±0.38) cm，初始體重為(2.03±0.33) g，購回后馴養7 d。馴養期間，水溫為26℃，鹽度為29。每天定時投喂3 次人工配合飼料(主要成分：水分8.31%、粗蛋白43.50%、粗脂肪6.94%、灰分12.19%)。

1.2 實驗設計與管理

通過預實驗得知凡納濱對蝦96 h 半致死濃度(96 h-LC50)為150 mg/L NO2–-N，以該濃度的20%為慢性脅迫實驗最高濃度組，等比例設計4 個濃度組：NO2–-N 濃度分別為0 (對照組)、8 mg/L(N8 組)、15 mg/L(N15 組)和30 mg/L(N30 組)，進行持續36 d的NO2–-N 慢性脅迫實驗。每個處理設6 個平行，其中，3 個平行用于取樣，3 個平行用于記錄攝食量和存活率。

實驗在50 cm× 35 cm×35 cm 的玻璃水缸中進行，水體積為50 L，每個水缸(20 尾蝦)為1 個平行實驗。實驗持續36 d，每天換水1/2～2/3，通過添加10 g/L NO2–-N 母液保持各組脅迫濃度。實驗期間，各組實測NO2–-N 濃度分別為0～0.15(對照組)、7.31～8.12(N8 組)、14.13～15.45(N15 組)和28.92～32.23 mg/L(N30 組)。

實驗期間，溫度為26℃～27℃，pH 7.1～7.5，鹽度為29，總氨氮≤0.70 mg/L，非離子氨≤0.03 mg/L，溶解氧≥5.95 mg/L。每天07:00、14:00 和22:00 投喂人工配合飼料，飽食投喂。

在投喂飼料前10 min，虹吸去除各組水體中的糞便，投喂1 h 后，虹吸收集各組剩余飼料于250 目篩絹中，用0.5 mol/L 的甲酸銨沖洗，再放入70℃烘箱中烘干至恒重。通過預實驗測量出該飼料的含水量和在水中1 h 的溶失率，殘餌量由飼料的溶失率和含水量校正得到(林繼輝等, 2004)。每尾蝦單日攝食量為投餌量和殘餌量之差除以缸中生存對蝦數量得出。

1.3 生長相關指標計算

式中，W0為凡納濱對蝦初始體重(g)；Wt為凡納濱對蝦終末體重(g)；T 為實驗時間(d)；N0為凡納濱對蝦的放養數量；Nt為凡納濱對蝦終末數量；F 為每只蝦36 d 的總攝食量(g)。

1.4 對蝦樣品采集與分析

第1、3、6、12、24 和36 天隨機從各組取6 尾凡納濱對蝦，用一次性注射器從凡納濱對蝦腹血竇處按血淋巴與抗凝劑(450 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2-EDTA, 10 mmol/L HEPES, pH 7.3)體積比為1∶3 的比例抽血(Vargas-Albores et al, 1993)，抽出的血淋巴立即離心(4000 r/min, 10 min)，取上清液，經液氮快速冷卻后，放入–80℃超低溫冰箱保存待測。取對蝦肝胰腺和肌肉，同樣經液氮快速冷卻后放入–80℃超低溫冰箱保存待測。第36 天，隨機從各組取3 尾對蝦，測量對蝦全蝦體成分。

凡納濱對蝦血糖、肝糖原、肌糖原含量；肝胰腺與肌肉中己糖激酶(HK)活性和丙酮酸激酶(PK)活性；肝胰腺中的乳酸含量和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定均使用南京建成公司試劑盒，操作按照說明書進行。

全蝦樣品在105℃烘干至恒重來測定水分，粗蛋白采用凱氏定氮法測量，粗脂肪采用氯仿–甲醇抽提法測量，灰分采用550℃馬弗爐灰化法測量。

1.5 數據處理

實驗數據均采用平均數±標準差(Mean±SD)表示。分析之前測試數據的正態性(Shapiro-Wilk test)和方差齊性(Levene’s test)，若數據不具有方差齊性，則對數據進行lg 轉化并進一步測試。采用Tukey 多重比較檢驗對符合正態分布和方差齊性的數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。對于不符合正態分布及lg 轉化后仍不具有方差齊性的數據采用非參數檢驗，并通過Kruskal-Wallis 測試進行顯著性差異分析。P<0.05 表示各組數據差異顯著。

2 結果

2.1 亞硝態氮慢性脅迫對凡納濱對蝦生長和成活率的影響

NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦存活率、生長和攝食的影響見表1。從表1 可以看出，凡納濱對蝦的存活率隨著NO2–-N 濃度升高而降低，且N30 組顯著低于對照組(P<0.05)。各組的終末體重、特定生長率和相對增重率均隨著 NO2–-N 濃度上升而顯著下降(P<0.05)，其中，N15 組和N30 組之間沒有顯著差異(P>0.05)，N30 組的特定生長率和相對增重率分別僅為對照組的48.55%和29.68%。日攝食率和飼料轉化率隨著NO2–-N 濃度上升而下降，其中，N30 組的日攝食率是對照組日攝食率的66.20%。

2.2 亞硝態氮慢性脅迫對凡納濱對蝦體成分的影響

NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦體成分的影響見表2。從表2 可以看出，凡納濱對蝦的水分和對蝦干重的粗蛋白含量隨著NO2–-N 濃度上升而上升，但各組之間沒有顯著差異(P>0.05)；N30 組的粗脂肪含量顯著低于對照組(P<0.05)；各脅迫組灰分均與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表2 亞硝態氮慢性脅迫對凡納濱對蝦體組分的影響Tab.2 Effects of chronic nitrite nitrogen stress on body composition of L. vannamei

2.3 亞硝態氮慢性脅迫對凡納濱對蝦的糖代謝途徑關鍵酶活力和物質含量的影響

NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦血糖影響見圖1。從圖1 可以看出，第1 天，脅迫組的血糖濃度出現了下降的趨勢；第12 天，N15 組的血糖濃度顯著高于對照組(P<0.05)；第24 天，N8 組的血糖濃度顯著高于對照組(P<0.05)，說明N8 和N15 組血糖濃度在脅迫期間呈先下降再上升的趨勢，但最終在36 d 再次下降至顯著低于對照組(P<0.05)。而在脅迫期間，N30組的血糖濃度一直顯著低于對照組(P<0.05)。

NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦的肝胰腺和肌肉中糖原含量的影響見圖2 和圖3。第1 天，各組間的肝胰腺中糖原含量保持相對穩定，各組之間沒有顯著差異(P>0.05)；第3 天，N8 組肝胰腺中糖原含量顯著高于對照組(P<0.05)；第6 天，N15 與N30 組的肝胰腺中糖原含量顯著高于對照組(P<0.05)；第36 天時，脅迫組的肝胰腺中糖原含量顯著低于對照組(P<0.05)，說明脅迫組肝胰腺中糖原含量的變化趨勢與N8 組和N15 組的血糖含量變化趨勢相同。而在實驗期間，脅迫組對蝦肌肉中糖原含量始終顯著低于對照組(P<0.05)。

圖1 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦血糖濃度的變化Fig.1 Changes of blood glucose concentration of L. vannamei during chronic nitrite stress

圖2 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦肝胰腺中糖原含量的變化Fig.2 Changes of glycogen in hepatopancreas of L. vannamei during chronic nitrite stress

圖3 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦肌肉中糖原含量的變化Fig.3 Changes of glycogen in muscle of L. vannamei during chronic nitrite stress

NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦的肝胰腺己糖激酶活力影響見圖4。第6 天后，N8 組和N15 組的己糖激酶活力與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，但N30 組的己糖激酶活力一直高于對照組，且其肝胰腺中的己糖激酶活力在第 36 天時顯著高于對照組(P<0.05)。NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦的肝胰腺丙酮酸激酶活力影響見圖5。從圖5 可以看出，第1 天，脅迫組肝胰腺丙酮酸激酶活力顯著高于對照組(P<0.05)；第6 天后，其活力隨NO2–-N 濃度升高而升高，且N30 組的丙酮酸激酶活力始終顯著高于對照組(P<0.05)。

圖4 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦肝胰腺己糖激酶活力的變化Fig.4 Changes of HK activity in hepatopancreas of L. vannamei during chronic nitrite stress

圖5 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦肝胰腺丙酮酸激酶活力的變化Fig.5 Changes of PK activity in hepatopancreas of L. vannamei during chronic nitrite stress

NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦的肌肉己糖激酶活力影響見圖6。脅迫組肌肉中的己糖激酶活力先升高后降低，但除了脅迫開始的第1 天，脅迫組的己糖激酶活力均低于對照組，且在實驗期間各組之間無顯著差異(P>0.05)。NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦的肌肉丙酮酸激酶活力影響見圖7。NO2–-N 脅迫使肌肉中的丙酮酸激酶活力提高，最終在第36 天脅迫組都高于對照組。

NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦的肝胰腺乳酸脫氫酶活力影響見圖8。從圖8 可以看出，肝胰腺乳酸脫氫酶活力呈先上升后下降的趨勢。第1 天，各組肝胰腺中乳酸脫氫酶活力無顯著差異(P>0.05)，隨時間的延長，脅迫組肝胰腺的乳酸脫氫酶活力提高，且N30 組的乳酸脫氫酶活力顯著高于對照組(P<0.05)。第24 天后，脅迫組肝胰腺的乳酸脫氫酶活力下降，且在36 d 時，各組無顯著差異(P>0.05)。NO2–-N 慢性脅迫對凡納濱對蝦的肝胰腺中乳酸含量影響見圖9。NO2–-N 脅迫會提高凡納濱對蝦肝胰腺中的乳酸含量，N30 組肝胰腺中乳酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，但在36 d 時，各組的乳酸含量無顯著差異(P>0.05)。

圖6 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦肌肉己糖激酶活力的變化Fig.6 Changes of HK activity in muscle of L. vannamei during chronic nitrite stress

圖7 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦肌肉丙酮酸激酶活力的變化Fig.7 Changes of PK activity in muscle of L. vannamei during chronic nitrite stress

圖8 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦肝胰腺乳酸脫氫酶活力的變化Fig.8 Changes of LDH activity in hepatopancreas of L. vannamei during chronic nitrite stress

圖9 亞硝態氮慢性脅迫期間凡納濱對蝦肝胰腺乳酸含量的變化Fig.9 Changes of lactic acid content in hepatopancreas of L. vannamei during chronic nitrite stress

3 討論

3.1 亞硝態氮慢性脅迫對凡納濱對蝦存活和生長的影響

水體中NO2–-N 通過鰓絲進入對蝦體內，且隨著時間的延長在機體內各部位積累，影響對蝦的代謝，最終降低對蝦的存活率(Li et al, 2019)。在NO2–-N 慢性脅迫期間，凡納濱對蝦活動減少，攝食率隨著NO2–-N 濃度上升而顯著下降，在36 d 后，對蝦的生長指標和存活率均隨著NO2–-N 濃度上升而顯著下降。提示NO2–-N 慢性脅迫會顯著降低對蝦的存活率和生長速度，且降低程度與NO2–-N 水平呈正相關。

3.2 亞硝態氮慢性脅迫對凡納濱對蝦體成分的影響

在環境脅迫下，蝦類體內代謝加強，某些營養物質會耗竭或者合成受阻(于赫男, 2007; 鞠波, 2014)。為了滿足NO2–-N 急性脅迫引起的蝦類對能量需求的增長，日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)對氨基酸的利用可能比體內的脂質代謝起到更重要的作用(Jiang et al, 2014)；同時，凡納濱對蝦在慢性氨氮脅迫中，粗脂肪含量隨著脅迫濃度升高而下降，但粗蛋白含量卻隨著脅迫濃度升高而升高(曾慶婷等, 2016)。本研究發現，在NO2–-N 慢性脅迫下，隨著NO2–-N 脅迫濃度增大，凡納濱對蝦粗蛋白含量幾乎沒有發生變化，但對蝦的粗脂肪含量顯著下降，提示凡納濱對蝦對脂質的利用在應對NO2–-N 慢性脅迫中起重要作用。

3.3 亞硝態氮慢性脅迫對凡納濱對蝦糖代謝的影響

在適宜的生長環境中，動物的血糖濃度處于相對穩定的狀態，而當動物遭遇環境脅迫時，機體會迅速將糖原分解為葡萄糖以滿足其對營養物質和能量需求(李莉, 2011)。在NO2–-N 慢性脅迫前期，脅迫組的凡納濱對蝦肌肉中糖原迅速降低以支持體內的代謝需求，而在中期，脅迫組的血糖和肝胰腺中糖原含量卻存在提高的現象。研究發現，處于長期饑餓中的日本囊對蝦(Penaeus japonicus)(Hong et al, 2009)和處于被農藥敵百蟲污染環境中的羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)(Chang et al, 2006)的血糖與肝胰腺中的糖原含量也出現上升的情況，且最終含量低于對照組，本研究存在相似現象。推測是因為對蝦肌肉中糖原的分解轉運和體內糖原異生途徑的增強，使血糖和肝糖原在 NO2–-N 慢性脅迫中保持穩定與提高。在NO2–-N 急性脅迫下，甲殼動物的血糖含量在實驗期間始終高于對照組(Hong et al, 2009; Jiang et al, 2014;Li et al, 2019)。但本研究發現，在NO2–-N 慢性脅迫中，凡納濱對蝦體內的血糖和糖原含量最終均低于對照組，提示在NO2–-N 慢性脅迫下，蝦類體內的糖原含量和血糖含量持續被消耗，最終已經不能滿足體內對能量增長的需求。

NO2–-N 會使凡納濱對蝦的血藍蛋白轉變為脫氧血藍蛋白和變性血藍蛋白，導致凡納濱對蝦血淋巴載氧能力下降，使對蝦處于缺氧的狀態(寇紅巖等, 2014;Wang et al, 2019)，而當對蝦處于缺氧狀態和抵抗環境脅迫時，就會增強細胞質中的糖酵解途徑得到丙酮酸，最終獲得更多能量來滿足機體需求(郭彪等, 2008;李英等, 2012; 賈旭穎等, 2014; Wang et al, 2016; Shan et al, 2019)。己糖激酶和丙酮酸激酶都是糖酵解反應中重要的限制酶，而肌肉和肝胰腺是甲殼動物進行糖酵解的主要場所(郭彪等, 2008; 戴超等, 2014)。本研究表明，在NO2–-N 慢性脅迫下，凡納濱對蝦肝胰腺中的糖酵解途徑增強，而肌肉中的糖酵解途徑因為己糖激酶活力的降低而被抑制。在非離子氨慢性脅迫中，凡納濱對蝦肌肉中的己糖激酶和丙酮酸激酶也出現下降的現象(賈旭穎等, 2014)，提示在NO2–-N 慢性脅迫中，凡納濱對蝦可能通過加強肝胰腺中的糖酵解途徑來獲得更多的能量，而肌肉并不作為主要的糖代謝場所。但在慢性脅迫的后期，血糖和肝胰腺中糖原的含量已經消耗殆盡，肝胰腺中的糖酵解途徑無法產生足夠的能量與物質來滿足凡納濱對蝦體內代謝，此時，源于脂類代謝供能則可能起到一定作用。

乳酸脫氫酶是生物體內的無氧代謝標志酶，乳酸脫氫酶能將丙酮酸反應成乳酸，并獲得少量的能量(賈旭穎等, 2014; 連春盎等, 2017)。在亞硝態急性氮脅迫下，甲殼動物體內的乳酸脫氫酶活力和乳酸含量在脅迫期間始終顯著高于對照組(Hong et al, 2009;Jiang et al, 2014)。本研究中，脅迫組的乳酸脫氫酶先上升后下降，最終在養殖實驗36 d 結束時，各組的乳酸脫氫酶活力沒有顯著性差別，同時，各組肝胰腺中的乳酸含量有相同的趨勢，表明NO2–-N 脅迫會在短期內加強凡納濱對蝦的無氧呼吸，但隨著NO2–-N脅迫時間的延長，肝胰腺中的乳酸脫氫酶活力受到抑制，無氧呼吸減弱，產生的乳酸減少。以上研究結果表明，在NO2–-N 慢性脅迫前期，對蝦通過加強體內無氧代謝途徑以應對脅迫效應；而在脅迫后期，對蝦無氧代謝供能減弱，其應對脅迫效應的供能途徑可能發生改變。關于NO2–-N 慢性脅迫對對蝦能量代謝途徑的影響及其機制，還需進一步研究。

4 結論

NO2–-N 慢性脅迫會降低凡納濱對蝦的生長率和存活率。為了應對NO2–-N 脅迫，凡納濱對蝦會加強體內糖的無氧代謝途徑來獲取能量，應對脅迫效應。然而，在長期NO2–-N 脅迫下，對蝦體內的血糖含量和糖原含量均被消耗殆盡，糖代謝已經不能為對蝦應對脅迫效應提供充足的能量，同時，根據粗脂肪含量變化，表明凡納濱對蝦通過脂類代謝供能在應對NO2–-N 慢性脅迫過程中起到重要作用。