輪狀病毒減毒活疫苗感染性滴度一步法RT-qPCR檢測方法的建立*

杜加亮，劉悅越，張 永，趙榮榮，趙一榮，韓 菲，劉 艷

(中國食品藥品檢定研究院腸道病毒疫苗室,北京 102629)

輪狀病毒是世界范圍內導致5歲以下兒童嚴重腹瀉的最主要病原體。自2001年輪狀病毒疫苗問世以來，全球已經有100多個國家和地區在使用。在疫苗問世之前，輪狀病毒相關胃腸炎(RVGE)在5歲以下兒童中每年導致超過50萬死亡病例[1]。雖然疫苗的問世減少了死亡病例，但是在低收入國家，RVGE每年仍然導致超過20萬死亡病例[2]。輪狀病毒疫苗可有效降低RVGE的負擔，因此，對疫苗的評價顯得尤為重要，尤其是多價疫苗的鑒別和效力評價。常用的檢測方法為使用特異性抗體，通過熒光灶試驗(FFA)、空斑試驗或細胞培養半數感染量(CCID50)等來實現[3-5]，但是這些方法均涉及特異性抗體制備困難、操作復雜且要求高、耗時長、主觀性大、通量小等不足，不利于多價疫苗產品的精準配制和生產全過程的質量控制。相比之下，基于核酸的定量檢測方法具有試劑材料可及性強、可操作性強、一致性高、耗時短、通量大、結果更加客觀等優點，已經成功應用于甲型肝炎、腮腺炎病毒疫苗的滴度檢測[6-7]。MSD RotaTeq使用的就是基于細胞感染的核酸定量檢測方法[8]，但由于疫苗毒株不同，基因序列不同，細胞感染特點也不同，該方法需要針對不同疫苗毒株進行不同設計。輪狀病毒流行株因地區和年份而不同，G1、G2、G3、G4、G9型構成了我國的主要流行株[9]。國內某企業生產的五價人-牛重配輪狀病毒減毒活疫苗涵蓋了以上5種主要流行株。本研究針對該疫苗，參考現有方法[10]，設計一步法反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)，用于多價輪狀病毒疫苗的鑒別和效力評價。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 單價輪狀病毒參考品由國內某企業提供，病毒滴度分別為G1:1.04×107CCID50/mL，G2:1.05×107CCID50/mL，G3:1.76×107CCID50/mL，G4:3.96×107CCID50/mL，G9:3.45×107CCID50/mL。一步法熒光定量PCR試劑盒(RR064)和一步法反轉錄PCR試劑盒(RR057)購自TaKaRa公司，QIAamp Viral RNA Mini Kit購自QIAGEN公司。細胞培養液為Gibco RPMI Medium 1640(1×)+1%(v/v)谷氨酰胺+1%(v/v)雙抗+10%(v/v)胎牛血清。病毒稀釋液為Gibco RPMI Medium 1640(1×)+1%(v/v)谷氨酰胺+1%(v/v)雙抗+5 μg/mL胰酶。熒光定量PCR儀(7500)購自Thermofisher Scientific公司；恒河猴腎細胞MA104為實驗室保存。

1.2引物探針設計和質粒參考品制備 分別吸取200 μL G1、G2、G3、G4和G9型單價病毒原液，按照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說明書的步驟提取病毒RNA。利用通用型VP7引物VP7-F和VP7-R擴增各型單價病毒原液的VP7基因，見表1。目的條帶經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收后，與pEASY-T3載體連接。轉化DH5a大腸埃希菌感受態后，經過藍白斑篩選、PCR鑒定、酶切鑒定和測序驗證。測序結果經序列比對后，選擇型別間差異明顯的區段進行引物和探針設計(表1)，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。質粒純度符合要求(A260/A280為1.8～2.0)后作為備用參考品原液。質?？截悢?copy/μL)按照以下公式計算：(6.02×1012)×(質粒濃度ng/μL×10-9)/(質粒長度bp×660)。本研究中使用稀釋至107、106、105、104、103、102copy/μL的質粒作為參考品。

表1 本研究中使用的探針/引物信息

1.3細胞培養和病毒接種 取生長密度合適的MA104細胞，消化制成濃度約為1.2×106個細胞的懸液，鋪96孔細胞培養板，每孔200 μL，置于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養3～5 d后使用。使用病毒稀釋液進行待測病毒稀釋，置于37 ℃培養箱中活化60 min。取出預先鋪有MA104細胞的96孔細胞培養板，棄掉細胞維持液。把活化后的病毒加到相應的細胞培養孔中，每孔40 μL，每個稀釋度4孔，置于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養18～20 h。每孔中加入4.5% Triton X-100工作液10 μL，置于-70 ℃放置至少1 h。

1.4RT-qPCR 感染板室溫放置20 min直至解凍，1 000 r/min振蕩10 s，1 000 r/min離心1 min，從每孔中吸取15 μL溶液進行40倍稀釋作為RT-qPCR的模板。RT-qPCR反應體系為12.5 μL Buffer、0.5 μL反轉錄酶、0.5 μL Taq酶、上下游引物(10 μmol)各0.4 μL、探針(10 μmol)0.4 μL、5 μL模板、加水補足至25 μL。反應條件為42 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s(收集熒光)，40個循環。結果解釋：Ct值≤35且擴增曲線呈S型為陽性，否則為陰性。

1.5特異性檢測 每個血清型毒株特異性引物/探針對每個重配株的單價培養物進行RT-qPCR來確定方法的特異性。每對引物/探針都應選擇性地使G1、G2、G3、G4和G9重配株的VP7基因片段序列擴增。所有引物/探針只能對特異型擴增，對其他型無擴增或選擇性差異≥210倍。將滅活的其他腸道病毒[柯薩奇病毒A(CA16)、腸道病毒71型(EV71)和脊髓灰質炎病毒]進行RT-qPCR，Ct值≥35或無擴增。

1.6線性和范圍檢測 將單價輪狀病毒參考品以1∶15的稀釋倍數首次稀釋，然后以2.5倍倍比稀釋4種稀釋度，以基于細胞感染的RT-qPCR進行輪狀病毒體外感染效力測定。以Ct值對被測物濃度制圖，用最小二乘法進行線性回歸?；貧w方程的相關系數(r2)≥0.950 0。確定Ct值與被測物濃度呈線性關系的濃度范圍。

1.7重復性檢測 使用上述稀釋倍數的標本，采用RT-qPCR分析病毒感染效力。使用5個型的輪狀病毒特異性引物探針對每個型進行定量檢測，試驗重復3次，每次試驗4個重復，每個型的每個稀釋度共得到12個Ct值，其變異系數(CV)不超過10%。

2 結 果

2.1特異性 每個血清型毒株特異性引物/探針對每個重配株的單價培養物進行RT-qPCR來確定方法的特異性。每對引物/探針都應選擇性地使G1、G2、G3、G4和G9重配株的VP7基因片段序列擴增。所有引物/探針對其特異型擴增的Ct值與其對其他型擴增的Ct值比較，選擇性差異≥210倍。對其他型擴增的Ct值≥35或無擴增(圖1)。

圖1 特異性擴增曲線

表2 不同稀釋倍數和Ct值的線性相關系數(r2)

檢測次數G1(6.93～0.44×105CCID50/mL)G2(7.00～0.45×105CCID50/mL)G3(11.70～0.75×105CCID50/mL)G4(26.40～1.69×105CCID50/mL)G9(23.00～1.47×105CCID50/mL)10.990 70.995 20.977 60.952 30.975 820.993 10.993 30.960 30.936 50.975 830.993 90.990 00.949 50.964 30.997 6均值0.992 60.992 80.962 50.951 00.983 1

檢測次數G1(2.77～0.18×105CCID50/mL)G2(2.80～0.18×105CCID50/mL)G3(4.69～0.30×105CCID50/mL)G4(10.56～0.68×105CCID50/mL)G9(9.20～0.59×105CCID50/mL)10.995 80.974 30.999 10.991 40.997 920.990 90.988 40.988 60.986 20.993 430.986 20.980 20.991 70.996 80.999 2均值0.991 00.981 00.993 10.991 50.996 8

2.2線性和范圍 當使用全部5種稀釋度的檢測數值進行計算時，G1、G2、G3、G4、G9型的稀釋倍數和Ct值的線性r2為0.957 6～0.993 5；當使用前4種稀釋度的檢測數值進行計算時，G1、G2、G3、G4、G9型的稀釋倍數和Ct值的線性r2為0.951 0～0.992 8；當使用后4種稀釋度的檢測數值進行計算時，G1、G2、G3、G4、G9型的稀釋倍數和Ct值的線性r2為0.981 0～0.996 8(表2)。

2.3重復性 如表3所示，G1、G2、G3、G4、G9型重配株第1、2、3天重復檢測結果的CV值為0.65%～6.71%、0.72%～10.10%、0.05%～8.10%，不同日間結果的CV值為2.05%～13.54%，一般認為重復性尚好(CV<15%)。經統計學分析，同一日重復檢測結果和日間結果比較，差異均無統計學意義(P=0.917、0.746)。不同稀釋度間的檢測結果差異有統計學意義(P<0.001)，說明本研究中選擇的稀釋度可以有效反映不同感染劑量的病毒復制。不同血清型之間的檢測結果差異無統計學意義(P=0.345)，說明各個血清型的疫苗毒株感染MA104細胞后具有相似的復制特征。

表3 重復性檢測結果

3 討 論

對于經黏膜途徑感染的病毒來說，與天然病毒具有相同感染和復制方式的減毒活疫苗仍然是最有效的激發機體免疫保護的方式[11]。對于其他可經傳統方法制備的滅活病毒疫苗來說，生產工藝中也必然少不了存在活病毒的滅活前階段[12]。因此，開發快速、簡便的滴度檢測方法顯得尤為重要。本研究初步建立了一種快速、靈敏、特異的檢測多價輪狀病毒減毒活疫苗病毒滴度的技術，該方法對其他腸道病毒(CA16、EV71和脊髓灰質炎病毒)無擴增，特異性符合要求；當使用前4種稀釋度的檢測數值進行計算時，5種型別的稀釋倍數和Ct值的線性r最高，均在0.980 0以上，故選擇前4種稀釋度作為該方法的線性和范圍；重復性檢測結果顯示，該方法在同一工作日內和不同工作日間均能得到差異無統計學意義的結果，重復性符合要求；不同稀釋度和不同血清型之間的統計學分析結果也顯示該方法在線性和范圍內可有效反映不同病毒株的復制情況。因此，該方法具有一定的推廣應用價值。

另外，輪狀病毒流行株因地區和年份而不同，G1、G2、G3、G4、G9型構成了我國的主要流行株[11]，G8型也時有檢出[12]。我國多家企業都在進行多價輪狀病毒疫苗的研發。多價輪狀病毒疫苗是以動物來源的輪狀病毒為母本，是將其主要抗原成分VP7和/或VP4替換成人源輪狀病毒的相應組分制備而成的。正是多價疫苗各個毒株之間的這種微小差異(主要抗原成分不同)，使多價疫苗的鑒別和效力檢測需要用到型別特異性單克隆抗體[4-6]。但是基于特異性單克隆抗體的檢測方法存在多種影響檢測結果和操作過程的因素，不利于多價疫苗產品的精準配制和生產全過程的質量控制。與基于特異性單克隆抗體的檢測方法相比，一步法熒光定量PCR不僅縮短了檢測時間，而且極大地減少了操作步驟，使檢測結果具有更好的一致性和客觀性。另外，該方法還具有以下2個方面的優勢，一是該方法建立在細胞感染的基礎上，疫苗中的活病毒得以復制和擴增，而死病毒無法復制，最終檢測結果能夠客觀反映病毒滴度；二是整個操作過程省去了核酸提取的步驟，避免了核酸提取步驟中存在的核酸損失情況造成的誤差。

本研究在進行重復性驗證時，臨時使用了質粒參考品，但是在正式使用過程中，需要制備一批性質均一，且能長期穩定保存的標準疫苗作為標準品對待測品進行賦值[8-9]，從而可以在疫苗生產工藝的各個環節(包括病毒液的收獲時間、半成品及成品的配制等)進行生產指導和質量控制。

4 結 論

對于病毒疫苗的質量控制來說，滴度或者效價的檢測是最重要的指標。RT-qPCR的建立和后續的適用性研究將為滴度或者效價檢測提供簡便、快速的方法，將更加有利于不同企業生產的相同品種的病毒疫苗之間結果的可比性研究。