智能識別鑒定M蛋白分型

王仁浩，謝 婧，管仲斌，謝松業△

(1.上海蘭衛醫學檢驗所股份有限公司醫學檢驗科，上海 200335；2.澳大利亞阿德萊德大學，澳大利亞南澳大利亞州阿德萊德 5005)

M蛋白分型種類多,診斷方法除流式細胞外[1-2]，血清蛋白電泳及免疫學方法已成為確診M蛋白血癥的重要手段[3-4],其中血清免疫固定電泳對多發性骨髓癌(MM)患者血清中的單克隆免疫球蛋白(Ig)進行分型鑒定具有高特異性和高靈敏性[5]。雖然免疫固定電泳圖譜簡單,但在目前臨床醫學檢驗中對M蛋白的分型、判斷、識別均是通過人工肉眼觀察，易產生主觀判斷誤差及漏判。本文釆用計算機智能鑒定免疫固定電泳M蛋白成分主要的思考方法是先找到M蛋白帶，再根據其他5個不同組分的圖像信息進行綜合匹配處理。根據健康人的免疫固定電泳6組的一維數據的峰高與峰寬的閾值范圍來判斷患者血清免疫固定電泳某組分峰值特征是否有意義，即患有M蛋白血癥。最后，鑒別出不同類型的M蛋白，并給出結果。這樣大大提高了M蛋白血癥的篩查效率，減少了人為誤差,為臨床診治和預后提供了科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 標本采集：15例免疫固定電泳(書)示范圖片[6]，35例M蛋白血癥標本中包括20例不同類型M蛋白血癥患者和15例健康人。標本由上海交通大學附屬第一人民醫院實驗室提供。

1.2儀器與試劑 (1)試劑：美國Helena公司提供，試劑批號：3415和3416和3417；(2)儀器設備：全自動快速電泳分析儀由美國Helena公司提供，為SPIFE 3000型或SPIFE4000型；(3)參數設置和操作步驟：詳見REP電泳儀操作規程；(4)掃描儀：Canon KEW36823。

1.3方法

1.3.1免疫固定電泳測定 方法學原理：免疫固定電泳將血清或其他標本在瓊脂(醋酸纖維素)平板上做區帶電泳，然后在其上加入已知相應單價抗血清，當抗體與其區帶中的單克隆Ig結合后，便形成抗原抗體復合物沉淀(固定)下來。通過漂洗和染色，呈現濃而狹窄的著色區帶，即可判斷單克隆Ig的輕鏈和重鏈類型。一般免疫固定電泳鑒定M蛋白成分主要由6個組分組成:(1)蛋白電泳;(2)IgG;(3)IgA;(4)IgM;(5)免疫球蛋白κ鏈;(6)免疫球蛋白λ鏈。第1組分為總的血清蛋白成分，第2～4組分為“重鏈”(其實免疫球蛋白是由2條重鏈和2條輕鏈組成)，第5～6組分為輕鏈，共由6個組分的電泳帶組成。健康人免疫固定電泳中的蛋白電泳只出現清蛋白等5種蛋白成分，不出現M蛋白成分區帶,且IgG、IgA、IgM及κ鏈和λ鏈電泳帶顏色較淺，掃描后一般峰寬大于峰高。采用不同的顏色把3幅峰形電泳圖合并為一張電泳圖，便于直觀顯示給醫生，為診斷疾病提供合理的依據。

1.3.2設計思路 首先，把6幅圖像經過掃描轉換成數據信息。其次，將二維數據轉換成一維數據，為了便于智能化鑒定M蛋白成分，采用不同的顏色把6幅電泳圖數據信息繪制成一張電泳圖，先在其中血清蛋白電泳中找到M蛋白帶，再根據其他5個不同組分的圖像信息進行綜合匹配處理。為了便于參數傳遞，根據健康人的免疫固定電泳6組的一維數據的峰高與峰寬閾值范圍來判斷患者血清免疫固定電泳某組分峰值特征是否有意義，即是否患有M蛋白血癥。最后鑒別出不同類型的M蛋白，并給出結果。免疫固定電泳智能化鑒定M蛋白成分的電泳流程見圖1。智能化鑒定免疫固定電泳M蛋白成分電泳特點，(1)正常：若蛋白電泳沒有找到M蛋白帶,而且重鏈和輕鏈峰值特征全部無意義輸出正常；(2)正常？建議復做:僅僅蛋白電泳峰值有意義其余峰值無意義輸出“正常？建議復做”;(3)游離κ、λ型輕鏈病:若蛋白電泳出現M蛋白,重鏈峰值特征無意義且κ和λ型輕鏈同時有特征性意義時輸出游離κ、λ型輕鏈病;(4)游離κ型合并κ型IgA單克隆免疫球蛋白病:當κ或λ有2個有意義峰值a和b時，若IgA有一個有意義的峰值c，a與c橫坐標相同，b與c坐標不同，則輸出游離κ型合并κ型IgA單克隆免疫球蛋白病;(5)游離κ型輕鏈病:若κ或λ有特征意義峰值，并且重鏈峰值全部無特征意義，則輸出“游離κ型輕鏈病”;(6)κ型IgA單克隆免疫球蛋白病:若蛋白電泳出現M蛋白帶,κ或λ峰值有價值，同時存在有價值的IgA或IgM或IgG，并且前一組峰值橫坐標與后一組峰值橫坐標相符，則輸出κ型IgA單克隆免疫球蛋白病;(7)κ型IgA單克隆免疫球蛋白病(？):若蛋白電泳出現M蛋白帶,κ或λ有價值峰值，同時存在有價值的IgA或IgM或IgG,但前一組峰值橫坐標與后一組峰值橫坐標不相符，則輸出κ型IgA單克隆免疫球蛋白病(？);(8)多克隆病:κ或λ有價值，同時IgA或IgM或IgG為有價值寬峰(波高>100同時波寬>波高)，其中峰值“有意義”指峰高大于峰寬4∶1。重鏈指IgG、IgA、IgM，輕鏈指κ型、λ型。

1.3.3實驗過程 (1)利用按鍵精靈電腦軟件把50幅免疫固定電泳圖片按圖中不同深淺的藍色條帶轉化為數據信息，再將二維數據轉化為一維數據。根據M蛋白與蛋白電泳對應的位置、區帶深淺、寬窄的不同即峰值數據的位置和大小及左右峰谷的長度，確立峰高度與峰寬度的比例范圍,血清M蛋白在蛋白電泳中可在α2至γ區形成濃度高的區帶,掃描圖中可見基底較窄,高而尖銳的峰,在γ區蛋白峰高大于峰寬，在β區和α2區也是如此,以此參數來判斷M蛋白的真偽,大大減少了肉眼判斷的誤差，見圖2。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析處理。智能和傳統兩種方法鑒定M蛋白成分的差異采用χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 智能化鑒定M蛋白帶流程圖

注：基線與IgM重合。

2 結 果

2.1把圖片生成的數據用自編軟件的程序轉化為直觀的一個峰值圖譜，儲存在Excel文檔中。

2.2按免疫固定電泳的區帶位置染色的深淺和峰高與峰寬的比例關系，采用計算機語言編程，智能化鑒定免疫固定電泳M蛋白成分，最后鑒別出不同類型的M蛋白，并做出結果。

2.2.1采用免疫固定電泳法用SPIFE3000或4000型全自動電泳儀獲得血清標本的6張凝膠電泳圖。

2.2.2掃描6張電泳圖片，輸入計算機。

2.2.3用按鍵精靈軟件，將6張電泳圖片掃描轉換成一維數據儲存在Excel文檔里。

2.2.4用自編軟件打開步驟C獲得的Excel文檔數據，軟件可以從中獲得免疫固定電泳中蛋白電泳(DY)、IgG、IgA、IgM、κ型、λ型數據。獲得各條線的參數，包括：峰值坐標、左波谷坐標、右波谷坐標、波寬是否大于波高峰值、各線峰值；然后根據患者蛋白電泳中ɑ至λ區域的峰值與標準峰值(健康人)同區域的數據比較大小。如果患者輸出的峰值比標準峰值大,則這條線的峰還要進一步判斷是否有價值,也就是根據左波谷坐標至右波谷坐標的峰寬是否大于峰高,如果峰高大于峰寬,判斷為有價值(含M蛋白帶),然后進一步按流程鑒定為哪一類型的M蛋白。

2.2.5輸出鑒別結果 根據判斷M蛋白帶的理論依據尋找屬于哪一類單克隆免疫球蛋白病,并打印報告，包括κ和λ鏈的比值。κ和λ鏈的比值在采用傳統免疫固定電泳方法肉眼判斷時是無法辨別的,因為肉眼不能判斷顏色的深淺確切值,而軟件采取的是按鍵精靈的捕色軟件,它可以測出κ和λ鏈的顏色深淺具體值,然而κ和λ鏈的比值在診斷多發性骨髓瘤是很有價值的。這個結果和免疫散射比濁法測定κ和λ鏈的比值具有良好相關性(n=38，r=0.889),經統計κ和λ鏈比值,健康人參考值為1.16±0.2(n=32)，所有M蛋白血癥患者中κ型患者κ和λ的比值明顯大于1.36，而λ型患者κ和λ的比值明顯小于0.96,這個軟件可以同時測定κ和λ鏈，減少了患者再次測定κ和λ鏈所帶來的麻煩。

本文提供一種利用鑒定免疫固定電泳M蛋白成分的系統，該系統包括以下設備：A步驟的設備為SPIFE3000或4000型全自動電泳儀，獲得血清標本的6張凝膠電泳圖;B步驟的設備為掃描儀：Canon KEW36823,掃描6張電泳圖片，輸入計算機;C步驟的設備為計算機用按鍵精靈軟件，將6張電泳圖片掃描轉換成一維數據儲存在Excel文檔中;D步驟的設備為自編軟件安裝計算機，它可以直接打開步驟C獲得的Excel文檔數據,然后進一步按流程鑒定為哪一種類型的M蛋白并輸出鑒別結果及圖像。見圖3～5。

圖3 κ型IgM單克隆免疫球蛋白病

2.3實驗的臨床應用 由作者和臨床免疫專家[6]選出50幅免疫固定電泳圖像包含血清蛋白電泳圖像。選擇原則是既滿足于常規檢查的M蛋白類型，又包括很少見的類型和書圖譜上的特例圖像，經掃描成圖片后，用按鍵精靈電腦軟件把圖片轉化為數據。采用計算機編程智能化鑒定免疫固定電泳M蛋白成分，通過對50幅免疫固定電泳圖像和血清蛋白電泳圖像的數據分析，評價自動掃描、鑒定的整體性能。

圖4 游離λ型單克隆免疫球蛋白病

圖5 κ、λ型IgG單克隆免疫球蛋白病

2.3.1實驗結果分析 采用聯想電腦M7150，CPU256M內存，完成資料標本50幅掃描、分析及鑒定，M蛋白區帶35，正確識別33(94.3%)，其中M蛋白IgG區帶κ型10,正確識別10(100%),λ型5,正確識別5(100%),κ、λ混合型2,正確識別2(100%)；M蛋白IgA區帶κ型3,正確識別3(100%),λ型+游離λ型1,正確識別1(100%)；M蛋白IgM區帶κ型3,正確識別3(100%),λ型1,正確識別1(100%),κ、λ混合型1,正確識別1(100%),混合型λ型IgM + κ型IgG 1,正確識別1(100%),游離κ區帶1,正確識別1(100%),游離λ區帶7,正確識別7(100%)。正常人區帶15,正確識別15(100%)。

2.3.2性能驗證 智能和傳統兩種方法鑒定M蛋白成分差異無統計學意義(P>0.05)。智能化鑒定M蛋白成分方法的正確度為96.0%，靈敏度為94.3%，特異度為100.0%，假陰性率(漏診率)為4.0%，假陽性率(誤診率)為0.0%,陰性似然比為6，Kappa值為0.908，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為88.0%。

3 討 論

M蛋白血癥是一種漿細胞異常增生的惡性腫瘤，浸潤骨髓和軟組織產生M球蛋白及多肽，引起骨骼破壞、腎臟病變和貧血,但該病起病緩慢，無癥狀期長短不定,短至幾個月長達十余年，由于癥狀多樣化及個體差異，出現的臨床表現繁多和復雜，初發病常常不被發現而多被誤診。亞州人MM發病率為0.5/100 000～1.0/100 000[7]，70歲以上的老年人發生率為3%，通過骨髓涂片、組織活檢、X線片來診斷外,其他血清蛋白電泳及免疫學方法已成為確診MM的重要手段，其中血清免疫固定電泳是對MM患者血清中的單克隆免疫球蛋白進行分型鑒定，具有高特異度和高靈敏度，也可以識別M蛋白雙克隆[8]。目前缺乏標準化鑒別分型方法,臨床醫學檢驗中對M蛋白的分型、判斷、識別都是人工肉眼觀察，易產生主觀判斷誤差及漏判。應用計算機模式識別技術,能做到與醫學檢驗專家一樣，智能快速、準確地識別細胞[9]和DNA凝膠電泳分子量測量[10]，但未見智能鑒定M蛋白的成分。本系統應用電腦掃描模式識別技術，采用可對血清蛋白電泳和免疫固定電泳圖譜實現自動識別、分類、綜合分析給出正確鑒別結果,該方法可以同時計算出κ和λ鏈,因為肉眼不能判斷顏色的確切深淺值，然而κ和λ鏈的比值診斷MM是很有價值的[11-12]。這個軟件可以同時測定κ和λ鏈比值,減少了患者再次測定κ和λ鏈所帶來的麻煩。通過對50幅免疫固定電泳圖像的數據分析，雖然合并游離輕鏈判斷有漏檢,但評價自動掃描整體性能的鑒定及臨床應用準確度達96%,Kappa值達0.908，與傳統方法比較差異無統計學意義(P>0.05)。

4 結 論

計算機能做到與醫學檢驗專家一樣，智能快速、準確地識別M蛋白的成分，并鑒定出是哪一種類型的M蛋白病,提高了檢查效率，減少了人為誤差，給臨床實驗室帶來了極大的方便，也為臨床醫生鑒別診治和預后提供了科學依據。