Crk1/2與CrkL缺失導致足細胞損傷的蛋白質組學分析*

杜佳琳，段 楠，逄 璐，黃海明，黃辰煒，李海霞

(北京大學第一醫院檢驗科，北京 100034)

足細胞是錨定在腎小球基底膜的高度分化終末細胞，具有復雜的骨架結構，是腎小球濾過屏障的重要組成部分，其損傷是導致腎小球蛋白尿的主要機制，并且與各類腎小球疾病的發生和發展密切相關[1]。在足細胞損傷模型中，足細胞內某些蛋白的表達水平會發生明顯變化，特定基因的缺失會導致足細胞結構與功能受損，因此，明確導致足細胞損傷的特定分子，對于治療腎小球疾病至關重要[2-3]。Crk家族蛋白Crk1/2與CrkL是重要的信號轉導蛋白，二者結構相似，功能互補，參與細胞黏附、遷移、增殖、凋亡及免疫等多個生物過程，在許多腫瘤疾病中呈高表達，并且對維持正常細胞的形態和功能至關重要[4]。既往研究表明，足細胞Crk1/2與CrkL缺失會導致板狀偽足形成異常，細胞骨架重排及細胞黏附、遷移與活力受損[5-6]。盡管Crk1/2與CrkL在足細胞中發揮了重要生物作用，但此過程中涉及的上、下游分子機制尚不明確。為進一步了解Crk1/2與CrkL在足細胞中的作用，本研究采用非標記定量蛋白質組學方法對Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降的足細胞和正常足細胞中的蛋白質譜進行比較，根據所得信息分析由Crk家族蛋白缺失介導的復雜蛋白網絡，進一步探索腎小球疾病的病理生理機制。

1 材料與方法

1.1材料 條件永生化人足細胞(HPCs)由美國安德森癌癥中心龍慧茵教授饋贈；Opti-MEM低血清培養基(美國Gibco公司)；小干擾RNA(siRNA，中國生工生物工程股份有限公司)；轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX(美國Invitrogen公司)；抗Crk1/2抗體(美國BD公司，1∶2 000)、抗CrkL抗體(英國Abcam公司，1∶500)、抗LRP1抗體(英國Abcam公司，1∶2 000)、抗超氧化物歧化酶2(SOD2)抗體(英國Abcam公司，1∶2 000)、抗TPM4抗體(英國Abcam公司，1∶3 000)、抗c-Jun抗體(英國Abcam公司，1∶3 000)、抗Cdc42EP1抗體(英國Abcam公司，1∶4 000)、抗GAPDH抗體(英國Abcam公司，1∶2 000)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 HPCs于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和1×胰島素-轉鐵蛋白-硒(ITS)的RPMI1640培養基中傳代培養。增殖條件為33 ℃，當細胞密度達到70%～80%時，轉入37 ℃，培養基去除ITS，培養10～14 d誘導分化，之后用于試驗。

1.2.2試驗分組及siRNA轉染 試驗分為4組：空白對照組(轉染陰性對照siRNA，siCtrl)、Crk1/2單敲降組(轉染Crk1/2 siRNA，siCrk1/2)、CrkL單敲降組(轉染CrkL siRNA，siCrkL)、Crk1/2與CrkL雙敲降組(共轉染Crk1/2 siRNA與CrkL siRNA，siCrk1/2+siCrkL)。當分化好的HPCs細胞密度達到70%～80%時，利用Opti-MEM低血清培養基稀釋siRNA與Lipofectamine RNAiMAX，二者混合均勻，室溫孵育10 min后，滴加至細胞培養基中。轉染72 h后，收集細胞提取蛋白，采用Western blot試驗進行沉默效率驗證。

1.2.3Western blot分析 轉染72 h后，采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，4 ℃條件下以1 200 r/min離心15 min后取上清液用于Western blot試驗。Western blot試驗過程如下：將20 μg蛋白上樣至濃度為10%的分離膠中進行電泳分離，然后轉移至聚偏氟乙烯膜。轉膜完畢后用5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，之后加入一抗，4 ℃過夜。第2天復溫后用Western blot試驗洗滌液洗膜，5 min×3次，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，再次用Western blot試驗洗滌液洗膜，5 min×3次。采用凝膠成像分析系統進行顯影，采用Image J軟件對各條帶進行灰度掃描。各試驗獨立重復3次。

1.2.4液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)分析 采用Bradford方法對細胞總蛋白進行定量，60 μg蛋白中加入5 μL二硫蘇糖醇(1 mol/L)室溫孵育1 h，然后加入20 μL吲哚乙酸(1 mol/L)避光室溫孵育1 h，采用離心法和超濾法去除DTT、IAA和低分子物質，按照50∶1的比例在37 ℃下孵育12～16 h進行胰蛋白酶消化。LC-MS/MS系統包括Agilent 1100 quaternary高效液相色譜儀和Q-Exactive Fusion Lumos質譜儀。樣本由自動進樣器上樣到C18反向柱(C18 3 μm 100 μm×2 cm)，再經分析柱(C18 1.9 μm 150 μm×12 cm)分離，洗脫液A為0.1% 甲酸/H2O，洗脫液B為0.08%甲酸/乙腈，流速為300 nL/min，洗脫時間為75 min。采用數據依賴采集模式進行質譜分析，相關參數設置如下：質譜掃描離子質荷比為350～1 550 m/z，掃描分辨率為6 000，自動增益控制系數(AGC)為400 000，最大離子時間為50 ms。二級質譜相關參數設置如下：掃描分辨率為15 000，AGC為20 000，最大離子時間為35 ms。所得質譜數據采用Proteome Discoverer軟件在Uniprot數據庫中進行蛋白質檢索鑒定。肽段和蛋白質鑒定錯誤發現率均小于0.01，允許最小肽段數目為1個。當上調蛋白差異倍數為1.5、下調蛋白差異倍數為0.67時，視為明顯差異蛋白。采用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(GO)分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析，采用STRING數據庫(http://www.string-db.org/)進行蛋白相互作用分析。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析處理。采用GraphPad Prism 6.0軟件制作統計圖。采用t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗和ANOVA檢驗進行比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降足細胞蛋白質組學分析及差異蛋白篩選 為了探究Crk1/2與CrkL在足細胞中的調節作用，本研究通過轉染siCrk1/2、siCrkL及siCrk1/2+siCrkL的方法實現足細胞內Crk1/2與CrkL的單敲降及雙敲降。如圖1A所示，siRNAs轉染足細胞后，Crk1/2與CrkL的表達水平與空白對照組比較明顯降低。為了探討Crk1/2與CrkL缺失對胞內蛋白表達的改變，本研究對3次獨立試驗的特異性敲降足細胞進行了蛋白質組學分析，相關工作流程如圖1B所示。利用蛋白質組學分析平臺對質譜數據進行處理和數據庫檢索。與siCtrl組比較，siCrk1/2組有291個差異蛋白，siCrkL組有315個差異蛋白，siCrk1/2+siCrkL組有576個差異蛋白。在這些差異蛋白中，有46個蛋白在3個試驗組中均表達上調，有52個蛋白在3個試驗組中均表達下調，如圖1C所示。下一步將對這98個差異蛋白進行進一步分析。

注：A為siRNA轉染后足細胞Crk1/2與CrkL的表達情況；B為定量蛋白質組學工作流程圖；C為差異蛋白篩選。

2.2Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降足細胞中差異蛋白通路分析 為了探究Crk1/2與CrkL基因敲降相關的生物學功能和途徑，本研究對98個差異蛋白進行了GO分析和KEGG分析。如圖2、圖3所示，生物過程分析提示大多數上調和下調蛋白質涉及以下3個過程：(1)細胞進程，包括肌動蛋白細胞骨架調節、信號轉導等；(2)生物調節過程，包括細胞形態調節和細胞凋亡過程調控等；(3)代謝過程，包括脂質代謝過程和氧化還原過程等。分子功能分析顯示，上調和下調的蛋白質主要富集在結合作用、蛋白結合、催化活性和水解酶活性等方面。此外，細胞組分分析提示，上調和下調蛋白質主要為細胞質成分。如圖4所示，對上調差異蛋白進行KEGG分析顯示，多數蛋白參與代謝途徑，包括果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝等。圖5對下調差異蛋白進行KEGG分析顯示，Crk1/2與CrkL缺失會影響足細胞內多種信號通路，包括抑制和激活蛋白1、磷脂酰肌醇三激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶和環磷酸腺苷等信號通路。這些差異蛋白的分布和功能為尋找與Crk1/2、CrkL的異常表達引起足細胞功能障礙有關的分子成分和信號通路提供了線索。

圖2 上調差異蛋白的GO分析

圖3 下調差異蛋白的GO分析

圖4 上調差異蛋白的KEGG分析

2.3Crk1/2、CrkL與差異蛋白間的網絡關系 為了進一步分析98個差異蛋白之間的網絡關系，本研究將其上傳至STRING蛋白質相互作用數據庫進行分析，結果發現，這些差異蛋白與Crk1/2和CrkL之間高度互連。此外，一些軟件預測的信號轉導分子，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)也出現在關系網中。轉錄因子c-Jun是MAPK的下游激活靶點，有調節細胞增殖、凋亡和分化的作用。在98個差異蛋白中，c-Jun與其他差異蛋白及被預測的蛋白質的連接數目最多，高達17個。與c-Jun相連蛋白包括SOD2、細胞間黏附分子1(ICAM1)和酪氨酸蛋白激酶等，這些蛋白質的連接為探究Crk1/2和CrkL缺失引起足細胞損傷和遺傳性Digeorge綜合征的機制提供了更多信息。

圖5 下調差異蛋白的KEGG分析

2.4目標蛋白Western blot試驗驗證 本研究選擇5個相關差異蛋白進行Western blot試驗驗證，并準備在下一步試驗中繼續進行深入的分子機制研究。如圖6所示，上述5個蛋白的Western blot試驗驗證結果與蛋白質組學數據相一致，證明了蛋白質組學結果的可靠性。

注：*P<0.05,△P<0.01,#P<0.001。

3 討 論

足細胞損傷是引起腎小球疾病的主要原因，既往研究表明，足細胞Crk家族蛋白的特異性缺失會導致偽足形成受阻[5-6]。為了研究Crk家族蛋白缺失引起足細胞功能障礙的分子機制，本研究分別對Crk1/2、CrkL單敲降及雙敲降的足細胞進行了蛋白質組學研究，以識別Crk1/2與CrkL調控的差異蛋白。

通過對上調和下調差異蛋白進行生物過程分析發現，上調的大部分差異蛋白都參與了代謝途徑，如氨基糖和核苷酸代謝、半乳糖代謝、碳代謝等。近年來，足細胞代謝紊亂已成為腎小球疾病的重要因素。線粒體功能障礙和代謝異?？梢栽谔悄虿∧I病、局灶節段性腎小球硬化和慢性腎臟病中觀察到，并被認為是腎臟疾病進展的主要驅動因素[7]。本研究提示，在Crk1/2和CrkL缺失導致的足細胞損傷過程中，代謝紊亂是一個非常重要的損傷機制。對下調差異蛋白進行KEGG分析發現，大部分蛋白富集在信號轉導通路(如Rap1、cAMP和PI3K-Akt信號通路等)上。STRING分析也顯示差異蛋白與其他信號轉導蛋白(如mTOR、MAPK8和MAPK9等)有密切關系。因此，生物信息學分析為Crk1/2與CrkL缺失引起足細胞功能障礙的研究提供了新思路。

在98個差異蛋白中，有5個與代謝、信號轉導和肌動蛋白骨架有關的差異蛋白已被Western blot試驗證實。TPM4是一種原肌球蛋白，是微絲骨架的主要結構，海馬神經元LRRK2的缺失會導致生長錐中產生更多的TPM4來穩定新合成的肌動蛋白微絲[8]。然而，對TPM4在腎臟疾病中的表達情況及其生物學功能還暫不清楚。本研究結果顯示，足細胞內Crk1/2與CrkL缺失導致足細胞骨架重排的過程伴隨著TPM4表達增加。因此，推測TPM4的表達上調可能是肌動蛋白絲斷裂后足細胞內的一種自我調節現象，其是否參與腎臟疾病的發病值得進一步探討。

細胞代謝相關蛋白SOD2為線粒體乙?；?(SIRT3)下游分子，可通過清除超氧化物來調節細胞活性氧(ROS)水平。有研究發現，經醛固酮或H2O2刺激的足細胞胞內ROS和SOD2生成增加，刺激前用人參皂苷-rg1處理足細胞可降低SOD2和ROS水平，防止足細胞損傷[9]。本研究中，SOD2在Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降足細胞中表達上調，其可能是應對胞內ROS水平升高的調節機制，過多的ROS會導致DNA、蛋白質和脂類氧化，損害足細胞內的細胞器，Crk1/2與CrkL敲降后可能會造成足細胞內ROS的異常表達。此外，一些膜性腎病患者足細胞SOD2表達水平增加，并可作為自身抗原，導致血漿中出現抗SOD2抗體，最終激活免疫應答攻擊足細胞[10]。因此，控制SOD2的表達對避免足細胞損傷有重要意義，Crk1/2、CrkL缺失導致的足細胞SOD2表達水平升高是腎小球疾病的危險因素。

LRP1是低密度脂蛋白受體家族的成員，具有超過40種不同的配體，介導多種細胞內信號通路，在Schwan細胞中，LRP1表達下調可通過抑制Rac1和激活RhoA來增加細胞黏附[11]。GO和KEGG分析表明，許多差異蛋白與代謝過程與信號通路有關[11]。TPM4在穩定微絲骨架結構中起重要作用，在3個試驗組中均表達上調。SOD2是一種重要的線粒體抗氧化劑，為SIRT3的下游介質，調節ROS產生，在3個試驗組中均表達上調。LRP1是LDL受體家族的一員，參與脂蛋白代謝，調節細胞增殖、遷移和肌動蛋白聚合，在3個試驗組中均表達上調。在STRING分析中，c-Jun與其他已鑒定和被預測的蛋白質的聯系最多，并且參與了多條信號通路，在3個試驗組中均表達下調。Cdc42EP1作用于Cdc42下游，誘導肌動蛋白絲聚合和偽足形成[11]，在3個試驗組中均表達下調。本研究中對足細胞進行Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降后，LRP1表達水平明顯增加，其可造成Rho GTPase等信號通路改變，最終導致足細胞功能紊亂。此外,1項基于膜性腎病微陣列和蛋白質組學數據的蛋白相互作用網絡分析表明，LRP1作為一個重要的靶基因，可能參與了膜性腎病的發病[12]。因此，Crk1/2、CrkL、LRP1與腎臟病之間存在重要聯系。

c-Jun是一種轉錄因子，參與多種生物過程，包括細胞增殖、分化和凋亡，它可以形成各種各樣的二聚體，識別AP-1位點和cAMP活化位點，從而調控信號轉導，多種細胞外刺激對c-Jun的誘導主要是通過ERK、JNK和p38級聯介導完成[13]。本研究STRING分析發現，c-Jun與其他已鑒定和預測的蛋白質有最多的相關連接。KEGG分析顯示，cAMP信號通路和PI3K-Akt信號通路的明顯富集與c-Jun密切相關，這一結果表明，c-Jun在接受Crk1/2與CrkL介導的信號轉導后表達下調，并通過調控其他相關蛋白，在足細胞損傷中起關鍵作用。

Cdc42EP1是一種Cdc42結合蛋白，作用于Cdc42下游，誘導肌動蛋白絲裝配和板狀偽足的形成，Cdc42EP1主要通過與活化的Cdc42-GTP、RhoQ、aPKC和ERK2相互作用而被調控[14]。在顱內神經嵴細胞中，Cdc42EP1與CRIB結構域相互作用，促進偽足突起。Cdc42EP1的缺失會導致細胞形狀變圓，并伴隨肌動蛋白結構紊亂和黏著斑損傷[15]。本研究的蛋白質組學分析顯示，Cdc42EP1在Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降的足細胞中均表達下調，提示Crk1/2與CrkL的缺失可以通過抑制Cdc42下游的Cdc42EP1調節Rho GTPases，誘導肌動蛋白纖維結構破壞，進而導致細胞形態改變。

4 結 論

綜上所述，本研究采用蛋白質組學方法探究了Crk1/2與CrkL缺失引起足細胞損傷的分子機制，為Crk1/2與CrkL在足細胞中的功能研究提供了新思路。本研究中，Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降的足細胞與正常足細胞相比共有98個差異蛋白，其中大部分蛋白與信號轉導和代謝過程相關。此外，5個關鍵蛋白：TPM4、SOD2、LRP1、c-Jun和Cdc42EP1已進行Western blot試驗驗證，證實它們在足細胞損傷過程中起關鍵作用，具體調控機制還有待進一步研究。