肺泡灌洗液和痰液涂片抗酸染色半定量與GeneXpert MTB/RIF半定量分析臨床應用*

劉桂治，周 旋,林茂銳，李明友,孫 亮，余子龍，曹東林

(廣東省第二人民醫院檢驗醫學部,廣東廣州 510317)

一直以來，結核病都是受全世界關注的公共衛生問題。根據我國結核病患者登記情況,廣東省是結核疫情最為嚴重的幾個區域之一[1-3]。GeneXpert MTB/RIF是近年來實驗室診斷結核病的新興技術，因其方便、快捷、靈敏度高，已在臨床廣泛應用[4-5]。隨著2017年頒布的新版肺結核診斷標準中加入支氣管鏡檢查及氣管、支氣管結核鏡下表現，肺泡灌洗液逐漸成為GeneXpert MTB/RIF檢測的主要標本[2]，結核桿菌載量的半定量對結核病患者的追蹤治療觀察有重要價值。本研究擬回顧性調查分析GeneXpert MTB/RIF技術和結核涂片抗酸染色半定量在臨床中的應用，探討不同類型的標本應用于該項診斷新技術對結核病診治的指導意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性調查分析本院2017年6月至2019年6月送檢的肺泡灌洗液患者820例，其中男499例，女321例，年齡15～89歲?；仡櫺哉{查分析本院同期疑似結核病患者249例，比較GeneXpert MTB/RIF半定量檢測與涂片抗酸染色半定量檢測結果。

1.2研究方法

1.2.1肺泡灌洗液與痰液標本準備[1]肺泡灌洗液收集：按照病變部位選擇灌洗肺段，將電子支氣管鏡頂端插入肺段支氣管開口處，經活檢孔注入2%利多卡因2 mL行肺段局部麻醉，然后注入37 ℃生理鹽水5～10 mL，重復灌洗肺部2～3次，收集肺泡灌洗液約15 mL，3 000 r/min離心15 min備用。痰液標本：患者晨起立即用清水漱口后，咳出深部的第2口、第3口痰液。收到痰液后進行痰液常規判斷是否為合格痰液，若不合格囑其重新留取。

1.2.2涂片抗酸染色 取0.05～0.10 mL患者痰液標本或肺泡灌洗液沉渣標本在玻片上涂抹成卵圓形的膜，面積為1 cm×2 cm，萋-尼氏染色法抗酸染色，鏡檢，涂片檢查按《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[1]操作。按照萋-尼氏染色鏡檢結果分級報告，抗酸桿菌陰性(-)：連續觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌，報告抗酸桿菌菌數1～8條/300視野；抗酸桿菌陽性(+)：3～9條/100 視野；抗酸桿菌陽性(++)：1～9條/10視野；抗酸桿菌陽性(+++)：1～9條/每個視野；抗酸桿菌陽性(++++)：≥10條/每個視野?？顾崛旧涸噭┖杏芍楹Ｘ愃魃锛夹g有限公司提供。

1.2.3GeneXpert MTB/RIF技術 GeneXpert MTB/RIF系統和檢測試劑盒由賽沛(上海)商貿有限公司提供。GeneXpert MTB/RIF技術不同標本類型按照儀器說明書規范操作。結核分枝桿菌檢測基于標本中結核分枝桿菌的Ct值，結果將以高、中、低或非常低來顯示，其中Ct<16為高水平，Ct為16～22為中等水平，Ct>22～28為低水平，Ct>28為極低水平。

2 結 果

2.1支氣管肺泡灌洗液標本的科室分布 在所有送檢標本中，呼吸與危重癥醫學科送檢率最高，為38.54%,其次是重癥監護室，為24.51%，其余科室送檢率較低，見表1。

表1 支氣管肺泡灌洗液標本的科室分布(n=820)

表2 GeneXpert MTB/RIF技術與涂片抗酸染色法檢測結果比較

2.2GeneXpert MTB/RIF技術與涂片抗酸染色法檢測結果比較 根據2017年肺結核診斷標準，挑選符合臨床診斷的病例249例，將249例按照標本類型分類，GeneXpert MTB/RIF技術與涂片抗酸染色法檢測結果見表2。結果顯示，痰液(137例)和肺泡灌洗液(104例)占大部分，其他標本類型如腦脊液(4例)、大便(2例)和關節穿刺液(2例)較少。其中痰液陽性預測值和陰性預測值分別為36.6%、95.5%；肺泡灌洗液的陽性預測值和陰性預測值分別為43.2%、98.3%。

2.3肺泡灌洗液與痰液在不同涂片半定量時GeneXpert MTB/RIF的Ct值比較 對GeneXpert MTB/RIF陽性標本(肺泡灌洗液44例，痰液71例)按照涂片半定量標準分類后比較，當涂片半定量結果為(-)、(+)時，肺泡灌洗液在進行GeneXpert MTB/RIF檢測時Ct值明顯不同于痰液，差異有統計學意義(P<0.05)； 當涂片半定量結果為(++)、(+++)、(++++)時，肺泡灌洗液在進行GeneXpert MTB/RIF檢測時Ct值與痰液差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 肺泡灌洗液與痰液在不同涂片半定量時GeneXpert MTB/RIF的Ct值比較

3 討 論

2011-2015年我國共登記結核病患者發病4 562 613例，死亡12 598例，其中僅培養陽性患者發病11 692例，患者的地區分布最高為廣東省[3]，這可能與廣東人口密度較高，空氣潮濕悶熱，使結核桿菌很容易傳播有關。目前，雖然我國結核病患者的數量正在逐年減少，但每年仍然有高達80多萬的發病數，表明我國在結核病的防治道路上依然任重道遠。已有研究表明，早期診斷和合理的治療對結核病的控制極為重要[1]。許多結核病疑似患者并沒有典型的影像學征象，部分初發患者也缺乏典型的臨床癥狀，因此，實驗室檢查就顯得尤為重要[6]。GeneXpert MTB/RIF技術是一項以結核分枝桿菌核酸擴增為基礎的全自動分子診斷方法，因其實驗環境要求簡單，操作容易，實驗人員技術要求門檻低，所以在世界范圍內容易推廣[7-8]。2017年頒布的新版肺結核診斷標準已經將結核分枝桿菌核酸檢測加為確診條件之一[2]。

隨著2017年頒布的新版肺結核診斷標準里加入支氣管鏡檢查及氣管、支氣管結核鏡下表現[2]，呼吸科及重癥監護室等結核重點監護科室對支氣管鏡診療日益重視，肺泡灌洗液送檢比例大大提高。本研究回顧性分析結果顯示，本院2017年6月至2019年6月肺泡灌洗液送檢科室以呼吸與危重癥醫學科及重癥監護室最多。其他科室送檢率較低，雖然與患者類型分布有極大聯系，但其他科室對支氣管肺泡灌洗液的診斷價值認識仍存在不足。將符合臨床診斷的標本(249例)的GeneXpert MTB/RIF技術檢測結果與對應涂片抗酸染色法結果進行比較，提示痰液和肺泡灌洗液標本陰性預測值較高(95.5%～98.3%)，與其他研究較為接近[9]，而陽性預測值較低(36.6%～43.2%)，這可能與綜合性醫院相對于傳染病?？漆t院，初次就診患者較多有關。其余標本類型由于數據有限，其預測價值有限，其中4例GeneXpert MTB/RIF技術檢測陰性，而涂片抗酸染色法陽性患者為非結核類分枝桿菌污染導致。表明GeneXpert MTB/RIF技術能夠大大提高結核病的陰性預測值，準確區分結核分枝桿菌與其他抗酸陽性的非結核分枝桿菌，這在其他研究中也有類似結論[10-11]。因此，對于結核患者的診斷，仍需結合其他影像學或病原生物學結果綜合分析。

結核桿菌的半定量對結核病患者的追蹤治療及觀察具有重要價值[1]，但GeneXpert MTB/RIF技術采用的半定量檢測與傳統的涂片抗酸染色半定量方法是否有一定相關性尚不清楚。本研究對臨床確診的結核患者回顧性調查發現，在GeneXpert MTB/RIF技術檢測陽性的標本中，當涂片抗酸染色半定量結果為(-)、(+)時，GeneXpert MTB/RIF檢測各組Ct值差異均有統計學意義(P<0.05)，說明GeneXpert MTB/RIF技術檢測Ct值對結核桿菌半定量有一定的提示作用。肺泡灌洗液應用于GeneXpert MTB/RIF技術檢測是否優于痰液？本研究調查表明，當涂片抗酸染色半定量結果為(-)、(+)時，肺泡灌洗液在進行GeneXpert MTB/RIF檢測時Ct值與痰液差異有統計學意義(P<0.05)；當涂片半定量結果為(++)、(+++)、(++++)時,肺泡灌洗液在進行GeneXpert MTB/RIF檢測時Ct值與痰液差異無統計學意義(P>0.05)。表明在結核患者細菌載量較高的情況下，采集肺泡灌洗液或痰液進行GeneXpert MTB/RIF技術檢測對病原學檢測結果判定影響不大，當細菌載量涂片抗酸染色半定量為(-)、(+)時，留取肺泡灌洗液有助于提高檢出率，這與邱文娜等[12]的研究有一定區別，在他們的研究中總體認為GeneXpert MTB/RIF技術檢測肺泡灌洗液靈敏度更高，這可能是因為他們沒有對細菌載量半定量區分的原因。在細菌水平較低時，進行針對性的肺段沖洗能夠增加結核桿菌的獲取概率，而痰液中經?；旌峡谘什科渌s菌，這些雜菌對結核桿菌的核酸擴增也會產生一定程度的抑制。當結核桿菌細菌載量較高時，結核桿菌的核酸水平和純度已經足夠高，在不同類型標本中擴增差異不大。因此，支氣管鏡診療的推廣應用是結核病防治能力提高的一項重要措施[13]。

4 結 論

結核病的實驗室診斷技術已取得極大的進展，新的檢測技術大大提高了結核病診斷的靈敏度和特異度，但不管是哪種檢測技術，均存在一定的局限性[14]。在研究新技術GeneXpert MTB/RIF應用深度的同時也要擴展其廣度，本研究提示，肺泡灌洗液相對于痰液在結核桿菌低載量時應用GeneXpert MTB/RIF技術具有更好的提示作用。未來聯合多種檢測技術，對疑似結核病患者同時進行診斷，綜合分析檢測結果，將成為結核病防治的重要方向。