毛細管電泳法檢測血清蛋白電泳的性能評估

安崇文，李海霞，焦莉莉

(北京大學第一醫院檢驗科，北京 100034)

血清蛋白電泳(SPE)是對血清中蛋白質進行質和量篩查的一種常見方法，尤其在腎病(如腎病綜合征、單克隆免疫球蛋白相關腎損傷)、肝硬化和漿細胞病(如多發性骨髓瘤)患者最具有特征性的變化，也是臨床對M蛋白血癥篩查最常見的一種手段，臨床診斷上意義重大，其診斷性能特征決定性取決于分析技術和評估質量[1]。目前，國內對于醋酸纖維素薄膜電泳法(CAE)和瓊脂糖凝膠電泳法(AGE)檢測SPE已有報道[2-5]，國內采用毛細管電泳法(CE)檢測SPE大多使用法國Sebia Capillarys電泳儀，相關研究也是基于該儀器的結果[6]，國內有關Helena V8全自動毛細管電泳儀的研究少見報道。本研究采用美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)EP文件對該儀器檢測SPE的性能進行評價，為其在臨床實驗室的應用提供幫助。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 檢測系統為配套系統，應用Helena V8全自動毛細管電泳儀，檢測系統試劑(Serum Protein SPE Kit批號：11471987，Storage Buffer批號：11512830，Maintenance Buffer批號：11494749，Serum Control-Normal批號：11394452，Serum Control-Abnormal批號：11404273)。

1.2評價方法 參考CLSI提出的EP評價方案對檢測系統性能進行評估。

1.2.1精密度評估 參考CLSI EP5-A2文件[7]進行確認。

1.2.2正確度評價 參考CLSI EP15-A2[8]推薦的分析具有指定值的物質，對2016年和2017年度美國病理學家協會(CAP)發放的室間質評物(ELP-A、ELP-B)及原衛生部臨床檢驗中心發放的室間質評物及廠家提供的指定值物質進行測定。

1.2.3相關性和偏差分析 參考CLSI EP9-A2文件[9]，選取本院患者血清標本40份，其SPE結果涵蓋正常和異常標本。分析系統間的相關性和偏差,并計算生物參考區間水平時的預期偏差(Bc)。以原衛生部臨床檢驗中心室間質評(EQA)標準的允許總誤差評判是否可接受，清蛋白(ALB)、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白允許偏差分別為10%、15%、15%、15%、10%。

1.2.4生物參考區間驗證 參考CLSI C28-A3c文件[10]，選取本院健康體檢人員男女各60例，年齡19～78歲，中位年齡42歲。結果與廠家給定的參考區間進行比較，以≤2例的檢測結果在給定參考區間外作為可接受標準。

1.2.5穩定性評估 取8份患者血清，于采集2 h內進行SPE檢測，分別于室溫(18～28 ℃)避光、4 ℃避光、-20 ℃避光條件下保存，標本采集后4、8、12 h及第1～10天進行SPE檢測，與采集2 h內檢測結果進行比較并計算平均偏差。

1.2.6M蛋白篩查情況評估 病例組選取89例免疫固定電泳法陽性的血清標本，對照組選取81例免疫固定電泳法健康體檢人員血清標本，將結果整理成四格表進行真實性評價統計。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析處理。采用Pearson相關進行相關性分析；偏差分析采用方差分析及Bland-Altman 差異分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1精密度評估 利用EP5-A2精密度方案進行驗證，結果符合要求，見表1。

表1 SPE EP5-A2的精密度驗證結果(%)

2.2正確度驗證

2.2.1檢測原衛生部臨床檢驗中心EQA物質的偏差結果 原衛生部臨床檢驗中心規定的允許總誤差，ALB、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白分別為20%、30%、30%、30%、20%，見表2、表3。

表2 檢測原衛生部臨床檢驗中心EQA物質的偏差結果(%)

表3 檢測CAP能力驗證物質的偏差結果(%)

2.2.2檢測Helena廠家提供具有指定值物質的偏差結果 由于上述評價物質均不能把β1和β2球蛋白組分區分開，故本研究又采用了廠家提供的具有指定值的評價物質，其驗證結果見表4，通過驗證。

2.3相關性和偏差分析 CE和AGE檢測SPE呈正相關，ALB、α1球蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白相關系數(r)分別為0.958 0、0.609 0、0.945 9、0.910 1、0.975 2(P<0.01)，其中僅α1球蛋白顯示為中度相關；對CE和AGE檢測結果進行方差分析，F值均大于F0.01(1.40)=7.31，證實二者之間差異有統計學意義(P<0.05)。偏差分析顯示，平均絕對偏差分別為-4.14%、2.80%、-1.86%、1.24%、1.98%，平均相對偏差為-7.79%、124.61%、-18.24%、11.33%、14.87%。CE和AGE檢測α1、α2球蛋白結果間存在明顯差異，結果一致性較差，無可比性，見表5。

表4 檢測Helena廠家提供具有指定值物質的偏差結果(%)

表5 CE系統在參考區間處可接受性評估(%)

2.4參考區間驗證 男性和女性生物參考區間驗證結果見表6、表7、圖1。α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白超出了規定數量，驗證不通過，證明廠家提供的美國人參考區間不適合我國人群。

表6 男性生物參考區間驗證結果(n=60)

2.5不同溫度條件下穩定性試驗偏差結果 比較8份標本在4 h至第10天不同溫度、不同時間條件下與采集2 h內結果的差異，見表8～10，變化明顯的為β2球蛋白，其在室溫和4 ℃避光保存平均偏差呈負增長趨勢，-20 ℃避光保存平均偏差均<10%；如果以偏差<10%為標準，提示室溫不宜超過8 h，4 ℃冰箱不宜超過4 d，-20 ℃避光保存10 d結果可接受。

表7 女性生物參考區間驗證結果(n=60)

圖1 雙清蛋白血癥SPE圖譜

表8 室溫條件下穩定性試驗偏差結果(%)

表9 4 ℃避光條件下穩定性試驗偏差結果(%)

續表9 4 ℃避光條件下穩定性試驗偏差結果(%)

表10 -20 ℃避光條件下穩定性試驗偏差結果(%)

2.6CE檢測M蛋白真實性評價結果 CE檢測M蛋白的靈敏度為0.753，特異度為0.988，ROC曲線下面積為0.870，95%CI為0.813～0.928。見表11。

表11 CE檢測M蛋白真實性評價結果(n)

3 討 論

本研究評價的CE檢測SPE的批內、批間CV均小于我國原衛生部臨床檢驗中心規定的1/4和1/3允許總誤差，而且均小于文獻[2-5]報道的CAE和AGE的精密度，在重復性上CE較凝膠法有明顯優勢，這可能是因為，一般基于凝膠條件下的電泳其蛋白質的分布是先在凝膠載體上進行定性，然后再基于染料的結合量進行半定量，屬于定性-半定量檢測。而CE是通過214 nm處的紫外光檢測蛋白質肽帶直接進行半定量檢測。

正確度驗證顯示，對原衛生部EQA和美國CAP能力驗證物質進行測定，結果均通過驗證，而本研究也同時檢測第3方機構(伯樂)提供的物質，α1球蛋白未通過驗證，相對偏差已遠遠超出允許總誤差(±30%)，分析原因可能與靶值制訂有關。而伯樂提供的靶值未把CE結果納入其中。由于上述評價物均不能把β1球蛋白和β2球蛋白組分區分開，故本研究又采用了廠家提供的具有指定值的評價物質，結果通過驗證。

相關分析顯示，CE和AGE檢測SPE呈正相關，僅α1球蛋白組分顯示為中度相關(r=0.609 0)，其余均顯示為高度相關。CE和AGE檢測結果經方差分析顯示，二者差異有統計學意義(P<0.05)。偏差分析顯示，α1球蛋白、α2球蛋白、γ球蛋白的平均相對偏差為124.61%、-18.24%、14.87%，均超出了規定。α1球蛋白、α2球蛋白在生物參考區間處的預期偏差也不可接受。整體來看CE與AGE檢測α1球蛋白、α2球蛋白、γ球蛋白結果存在明顯差異，結果一致性較差，無可比性，這與該組分中蛋白質所含的脂類或糖類多少有關，這些脂類或糖類是不能被蛋白染料著色的，如脂蛋白中的脂類和α1酸性糖蛋白中的糖類(如唾液酸)，α1酸性糖蛋白含糖量為45%，這些物質在基于凝膠的電泳中都會影響與染料結合，導致蛋白檢測比實際偏低。而在CE中應用的是直接紫外吸光度測量，不受這些脂類和糖類的影響，這是造成CE檢測α1球蛋白等組分與AGE偏差較大的原因，故CE的α1球蛋白組分參考區間也會明顯高于凝膠法。

生物參考區間驗證顯示，α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白超出了規定數量，驗證不通過，證明廠家提供的39例美國人參考區間不適合我國人群，實驗室應制訂本實驗室的參考區間。在驗證期間發現1例雙清蛋白血癥標本(圖1)，CE顯示ALB組分明顯分出2個峰，而AGE的ALB區帶并未出現2條條帶，而是出現1條較寬條帶，這可能與CE檢測SPE時增加了ALB組分的分辨率有關，導致CE對雙清蛋白血癥的檢測更加靈敏，這與國外報道采用CE比AGE發現雙清蛋白血癥例數多是相符的[11]。本例雙清蛋白血癥個體屬于健康體檢人員，并未大量使用抗菌藥物(如青霉素)和水楊酸等，也無胰腺疾病，可能與ALB的遺傳性基因變異相關，ALB有20多種遺傳變異，而這些個體是可以不表現出病癥的。

標本穩定性試驗顯示，β2球蛋白組分變化最明顯，這與血清中補體蛋白性質不穩定有關。補體蛋白占總蛋白的10%左右，其中補體C3、C4屬于β球蛋白，補體C3又是水平最高的，而β2球蛋白組分中主要是C3蛋白，易受各種理化因素的影響，溫度過高、紫外線照射等均可遭到破壞，在室溫和4 ℃保存時間越長，β2條帶越不清晰。故建議室溫避光保存8 h，4 ℃避光保存4 d，這與文獻[6]報道有差異。

對于SPE而言，最重要的就是發現并定量單克隆蛋白質(即M蛋白)，而CE篩查M蛋白的靈敏度不僅與AGE一致性較好[12-13]，還可以對M蛋白進行定量檢測。本研究的靈敏度為0.753，準確度為0.988，ROC曲線下面積為0.870，由此證實CE對于篩查M蛋白有良好的準確度，診斷價值較大。

本研究在篩查M蛋白試驗中，81例對照組中有1例采用CE檢測為M蛋白假陽性，分析原因可能與該標本為高球蛋白血癥有關。增多的IgA導致β2區峰值或β2與γ區間峰值增大造成錯誤解讀。89例M蛋白陽性標本中，有22例未被CE檢出，經免疫固定電泳法檢測其中8例為輕鏈型(7例弱陽性、1例與β區重合)，2例為IgAλ型(與β重合)，3例為IgGλ型(弱陽性)，2例為IgMλ型(弱陽性)，4例為IgMκ型(3例弱陽性、1例與β區重合)，1例為IgAκ型(與β區重合)，1例為IgGκ(弱陽性)和1例為IgG、IgM、κ、λ寡克隆型，綜合分析，可能被CE漏檢的M蛋白為單克隆輕鏈型患者、單克隆蛋白與β區或β1區重合的患者、低水平單克隆蛋白患者和寡克隆或雙克隆蛋白水平少的患者等。當患者存在少量M蛋白時，尤其背景中再加上多克隆免疫球蛋白增值的情況下，這些隱藏在正常區帶中的小單克隆蛋白是很難被CE和AGE檢出的，這種小單克隆蛋白的存在雖然尚未確定臨床意義，但它是反映疾病情況的線索，應加以重視[14]，如B細胞淋巴瘤、白血病、化學免疫抑制劑作用、原發性巨球蛋白血癥、重鏈病、輕鏈病、原發性淀粉樣變性、意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥、多神經病、皮膚黏液水腫樣苔蘚、多種慢性感染、結締組織病、非網狀內皮系統腫瘤、脂肪代謝障礙、慢性肝病、病毒感染、藥物過敏、癌腫、惡性淋巴瘤、自身免疫性疾病和免疫復合物疾病等均可能出現小單克隆蛋白區帶，同時進行免疫固定電泳法檢測可彌補上述不足。

4 結 論

CE檢測SPE的優勢在于增加了ALB、β球蛋白組分的分辨率，并且可對M蛋白進行量化，使雙清蛋白血癥更易檢出，區分開β1和β2球蛋白組分，β1球蛋白中主要是轉鐵蛋白，β2球蛋白中主要是補體C3，若M蛋白在β2區，AGE由于重合，很難分辨出來，而CE會使與β2區重疊的M蛋白更易檢出，可為臨床診斷和治療提供更多信息。