食品中副溶血性弧菌快速檢測技術應用進展

種婷

摘 要：食品安全是關系人民群眾生命、健康和社會穩定的重大公共安全問題。自2014年開始，微生物污染就成為了食品安全領域的焦點問題，而這種現象與全球食品安全面臨的問題相吻合。近年來，沿海地區和內陸食源性致病菌，特別是副溶血性弧菌引起的食物中毒發生率呈顯著上升的勢態，開發快速有效的副溶血性弧菌檢測技術意義重大。

關鍵詞：副溶血性弧菌;快速檢測;MALDI-TOF-MS

Abstract：Food safety is a major public safety issue related to peoples life， health and social stability. Since 2014， microbial contamination has become the major focus in the field of food safety， and this phenomenon is consistent with the global food safety problems. In recent years， the incidence of food poisoning caused by food borne pathogens， especially Vibrio parahaemolyticus， has increased significantly in coastal and inland areas. It is of great significance to carry out rapid and effective detection of Vibrio parahaemolyticus.

Key words：Vibrio parahaemolyticus; Rapid detection; MALEI-TOF-MS mass spectrometer

中圖分類號：TS207.4

副溶血性弧菌是一種嗜鹽菌，主要分布在河口、海洋及沿海地區，是引起沿海地區細菌性食物中毒的首要食源性致病菌，也是全國食源性疾病微生物病因的主要病因[1-2]。食品中副溶血性弧菌的檢測主要分為常規檢測和快速檢測兩種方法。常規檢測準確、可靠，但周期較長，操作繁瑣，當食源性疾病爆發時，無法快速鑒定出結果，無法滿足食品市場快速檢測的需要。因此快速檢測技術得到越來越多食品檢測人的青睞，并且逐漸取得權威檢測機構認可，其中發展較快的有免疫學、生物化學和分子生物學方法等，這些新技術應用于副溶血性弧菌的快速檢測中，不僅精確性高、特異性強，而且方便快捷，可以滿足現代快速檢測的需要。

1 副溶血性弧菌的免疫學檢測法

1.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫法其主要原理是抗原和抗體的特異性反應，載體上的酶與底物發生顯色反應，通過分光光度計對顯色反應進行測定。其特點是檢測快速、特異性好、通量高、靈敏度高，在食品副溶血性弧菌快速檢測中發揮了巨大作用。杜玉萍等[3]對不耐熱溶血素的基因進行克隆，并對其編碼的不耐熱溶血素蛋白進行純化和表達，從不耐熱溶血素蛋白免疫小鼠中提取抗不耐熱溶血素抗體，同時利用大白兔的抗副溶血性弧菌抗體建立酶聯免疫吸附試驗（ELISA）雙抗體夾心法，直接測定該菌的致病性，從而間接反映出副溶血性弧菌的不耐熱溶血素基因具有較強的特異性，該方法檢測不耐熱溶血性毒素的靈敏度為8～10 μg·mL-1。檢測不耐熱溶血素的特異性基因可以為該菌的感染情況提供有力依據。

1.2 免疫層析法

免疫層析法將免疫法和層析法的優勢有效結合，形成了一種更為簡便快捷、精準高效的檢測技術。免疫層析（ICTSs）探針主要有酶、膠體金、量子點脂質體等。免疫膠體金技術主要原理是使抗原/抗體被載體包被，載體通常以微孔濾膜為主，將包被好的抗原/抗體加入到待測樣品中，通過載體的毛細作用，使待測樣品中的抗原/抗體與載體中的抗體/抗原結合，再與膠體金標記物結合，從而被聚集在檢測帶上。向輝等[4]采用抗體與標記的磁性熒光納米顆粒相結合的免疫層析技術對副溶血性弧菌TDH基因進行檢測，特異性較高，濃度范圍為1～105 CFU·mL-1，比測定產葡萄球菌腸毒素B的金黃色葡萄球菌試紙條的靈敏度提高了100倍。

2 副溶血性弧菌的分子生物學檢測技術

2.1 實時熒光PCR法

實時熒光PCR又稱RT-PCR，其原理是通過高溫將模板基因裂解成單鏈，然后退火，兩條引物分別與單鏈上的一段序列結合，在聚合酶的催化作用下，以單鏈DNA為模板利用底物合成新的DNA片段，然后再次循環解鏈、退火延伸，從而達到擴增的目的。底物中加入了熒光基團，儀器通過采集熒光信號實時監測PCR反應系統。聞潔等[5]建立了復合探針實時熒光PCR技術對海產品中副溶血性弧菌tlh基因進行檢測。無需增菌狀態下，樣品含菌量為103 CFU·g-1（或103 CFU·mL-1）時即可檢出。增菌6 h時，只需1 CFU·g-1（或1 CFU·mL-1）的副溶血性弧菌即可檢出。該方法快速準確靈敏度高，大大縮短檢驗周期。

2.2 多重PCR法

多重PCR是在同一體系里加入2對以上引物，可同時檢測多個目標基因。蔣蔚等[6]采用多重PCR法針對groEL基因特異性擴增VP644bp目標片段，可同時分離霍亂弧菌、創傷弧菌和副溶血性弧菌，檢出限可達102 CFU·mL-1。高世光等[7]采用雙重熒光PCR法對副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因進行檢測，最低檢出限達到20 CFU·mL-1，100%特異度。Hossain MT等[8]建立的多重PCR可同時對特異性基因（tlh）和毒力基因（tdh和 trh）進行檢測，既能檢測出副溶血性弧菌的總量又能檢測出具有致病性的副溶血性弧菌數量。

2.3 LAMP法

日本學者Notomi T [9]于2000年在Nucleic Acids Res上公開環介導等溫擴增技術（LAMP），該方法具有反應時間短，操作簡單，靈敏度高，不需要特殊儀器，肉眼即可觀察結果等特點，適合基層快速診斷。相興偉等[10]針對副溶血性弧菌rox R基因和霍亂弧菌omp W基因建立一種雙重LAMP法，可同時對副溶血性弧菌和霍亂弧菌進行檢測。對60份海鮮樣品進行檢測，結果顯示檢出限達到3.12 fg，并且與其他菌株無交叉反應，100%特異性。模擬食品樣品檢出限達到50 CFU·mL-1。Malcolm TTH等[11]檢測海產品時同時采用多重PCR法和LAMP法進行檢測，當目標菌含量比較高時兩種方法區別不大，當含有痕量目標菌時LAMP比多重PCR靈敏度更高，具有明顯優勢。

3 MALDI-TOF-MS檢測技術

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）是食源性疾病鑒定和檢測的新技術。1988年，質譜和裂解技術初次聯合應用于細菌鑒定，此后利用質譜技術檢測微生物的序幕被逐漸拉開。質譜技術檢測食源性致病菌的主要原理是將基質化合物與經過預處理的待測樣品按照一定的比例混合，使待測物質均勻分散在基質化合物中。在脈沖激光的激發下基質分子被電離產生大量氫離子，氫離子轉移到樣品分子中，使其解析或電離，氣化后的樣品形成帶電離子。但在這一過程中，并沒有化學鍵的斷裂，只形成了多聚體。通過對多肽離子的采集和分析，得到圖譜并與數據庫中的標準圖譜進行對比，從而鑒定和區分菌種種類。

Ryan T Saffert等[12]用BD公司的Phoenix自動生化鑒定系統和Bruker公司的Biotyper MALDI-TOF-MS系統對440株革蘭氏陰性菌進行鑒定。結果表明，自動生化鑒定儀在屬水平和種水平上的準確率分別為83%和75%，MALDI-TOF-MS在屬水平和種水平上鑒定的準確率分別為93%和82%。MALDI-TOF-MS和自動生化鑒定儀鑒定常見菌株屬水平的準確率均能達到95%，對于不常見的菌株可鑒定到屬水平，兩者準確率分別為85%和52%，有顯著差異。由此可見MALDI-TOF-MS對不常見革蘭氏陰性菌的鑒定有顯著優勢。Mcelvania TeKippe E等[13]對239株革蘭氏陽性菌采用MALDI-TOF-MS法進行鑒定。其中220株鑒定屬水平的準確率達92.1%，181個分離株中167株鑒定到種水平的準確率達92.2%。Bruker公司的MALDI-TOF-MS數據庫有2 371個菌株，包含革蘭氏陰性菌、蘭氏陽性菌、酵母菌、絲狀真菌與分枝桿菌革蘭氏陽性等。菌株數據庫還在不斷增加和完善，質譜檢測會得到更廣泛的應用。

4 展望

傳統檢測副溶血性弧菌的方法操作繁瑣，費時費力，對檢測人員要求高，不能滿足快速檢測的需要。因此，免疫學和分子生物學已經成為快速檢測的主流。隨著新技術的發展，未來將是各項技術融合優化、聯合使用，如免疫磁珠與PCR聯用技術、免疫磁珠與LAMP聯用技術[14]、液相芯片與多重PCR聯用技術等[15]。MALDI-TOF-MS以快速、高通量和未知菌鑒定等特點成為近年發展起來的微生物快速鑒定檢測技術，在歐美等發達國家已經發展到較為成熟的階段，在我國還處于起步階段。我國已經發布了關于MALDI-TOF-MS檢測的國家標準，隨著相關研究的進一步深入，MALDI-TOF-MS將會成為未來快速檢測中不可或缺的重要手段。

參考文獻：

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