食源性致病菌活的不可培養狀態檢測方法研究進展

劉錦濤，夏 靜，喻志學，趙喜紅

（武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北武漢 430205）

1 VBNC狀態食源性致病菌介紹

活的不可培養狀態（Viable but non-culturable state，VBNC狀態）指細菌處在不利于自身生長繁殖的條件下，所表現出的一種特殊存在方式，是細菌為了延續生命而采取的一種特殊的生存策略。當細菌處于活的不可培養狀態時，其細胞體積會減小，在常規的平板上培養時，由于細胞失去了可培養性，故不能在平板上長出正常菌落。但細菌細胞仍具備代謝活性和生命活動，并在適宜其生長繁殖的環境下可以恢復到能夠培養的正常狀態即復蘇，故處于活的不可培養狀態的細菌仍具有致病性。1982年，徐懷怒研究團隊第1次很明確提出了活的不可培養狀態（VBNC狀態）這一概念[1]。這一概念是來源于對霍亂弧菌和大腸桿菌在遭到低溫脅迫時會進入仍然具有活性的“休眠”狀態的發現，這一概念的提出使人們意識到在世界范圍內霍亂病的周期性發生可能與霍亂弧菌的VBNC狀態有關系。繼徐懷怒等人提出活的不可培養狀態這一概念后，又有許多已知的細菌被報道可以進入活的不可培養這一細菌存在的特殊狀態[2]，迄今為止，已知有68種細菌都可進入活的不可培養狀態，其中大部分為人類致病菌，并且大多數人類致病菌進入活的不可培養狀態后仍然保持有一定的毒性，在適宜其生長繁殖的環境中可以被復蘇[3]。E.coli O157∶H7作為食源性致病細菌中的一種，能夠通過各種途徑傳播，如人類生存所必需的水源和食物等，其中食物傳播的主要是由于食品在加工制作過程中加熱不充分或溫度不夠高等原因所導致。除此之外，在食品加工過程中極端的溫度（如巴氏消毒、低溫保藏）、輻射（紫外消毒、遠紅外輻射、微波輻射、電離輻射）、干燥、高壓等因素易誘導E.coli O157∶H7的活的不可培養狀態的形成。

目前，關于誘導細菌進入活的不可培養狀態的機理尚不太明確，主要有3類假說[4]：一是細菌在不利于自身生長繁殖的環境中生存時，導致細菌細胞內一些使細胞程序性死亡的相關基因被環境脅迫作用激活，從而使細菌細胞不可培養，進入VBNC狀態，細菌得以在不良的環境中存活下來[5]。另一種是“細胞衰退學說”，一些學者認為，細菌細胞在不利于自身生長繁殖的環境中生長時，不良的環境作用會導致細胞內氧化，使細菌菌體受到損傷，生長衰退，從而使細菌細胞變成不能夠被培養的狀態。這種不能夠被培養的狀態能否恢復為能夠被培養的狀態，取決于細胞受傷害的深淺程度。若細胞損傷程度不大，則細菌最終在適宜的環境中可培養性會恢復。還有一些學者認為，細菌活的不可培養狀態的形成是類似于孢子的形成，是正常的細菌處于不利于自身生長繁殖環境中時，所表現出的一種休眠狀態，從而保證其能夠在不利于自身生長繁殖環境中存活下來[6]。

可以被復蘇是VBNC狀態致病菌重要的特征之一。當把導致細菌進入VBNC狀態的不利于自身生長繁殖的環境脅迫作用除去后，細菌的代謝活性和其可培養性會隨之恢復[7]。由于處于活的不可培養狀態的細菌不能在固體培養基上形成正常的菌落，導致傳統的平板涂布法（PC法）難以檢測出VBNC狀態的細菌，容易造成細菌檢測結果偏低，使人們低估細菌的危險。對于許多活的不可培養狀態的食源性致病菌來說，可能不會表現出致病性，但VBNC狀態的食源性致病菌在適宜條件下其可培養性仍可以復蘇并能夠表現出致病性，因此VBCN狀態的食源性致病菌會給食品安全帶來潛在的不可控風險[8]。因而，對食源性致病菌VBNC狀態的研究具有重要意義。

2 VBNC狀態食源性致病菌的檢測方法

常規的檢測方法無法檢測到不可培養狀態的細菌，就容易忽略處于活的不可培養狀態的食源性致病菌，構成食品安全和公共衛生行業的潛在威脅，只有找到針對活的不可培養狀態食源性致病菌快速有效的檢測方法才能夠解決這一問題。目前針對活的不可培養狀態食源性致病菌的檢測方法，主要包括分子生物學檢測法、免疫學檢測法和光學檢測法。這3種方法主要是對細菌的活菌數和總菌數進行快速有效的檢測，再聯合PC法得到細菌的可培養數，從而能夠檢測出是否有活的不可培養狀態的細菌存在。利用分子生物學的方法，能夠通過分析比較處于正常狀態的細菌與活的不可培養狀態的細菌在某些已知基因的表達上差異，從而判斷細菌是否進入活的不可培養狀態。

2.1 分子生物學法

因為分子生物學檢測法具有高效、快速、靈敏度高和特異性強等優點，所以采用分子生物學的方法檢測和分析活的不可培養狀態的細菌，已經成為目前實驗室檢測VBNC狀態細菌強有力的經常用到的手段。如今，采用分子生物學方法檢測VBNC狀態細菌主要是將一些DNA的核酸染料（如EMA和PMA） 與核酸分子擴增技術如聚合酶鏈式反應（PCR）、逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 和環介導等溫擴增（LAMP）反應等相結合的檢測辦法進行檢測。

核酸染料PMA與EMA是對DNA分子具有很好親和性和選擇性的2種熒光染料。當細菌細胞處于正常狀態時，由于具有完整的細胞膜結構，這些染料不能夠透過正常的活細胞膜和DNA分子進行結合的；當細菌細胞的細胞膜和細胞壁破損后，這些染料便能夠進入細胞和DNA分子進行結合，導致DNA分子不能被擴增，因此可以利用此類核酸染料與PCR反應、qPCR反應及LAMP反應等分子反應技術相結合，對活菌、死菌進行檢測[9]。

由于細菌的正常生長繁殖過程中其遺傳信息的轉錄和翻譯是同時發生的。故在細菌細胞中還未結束信使RNA的合成時，蛋白質的翻譯就已經開始了。并且，絕大多數的細菌所產生的信使RNA的穩定性極差，通常是翻譯結束其降解就隨之開始，半衰期較短。因此，信使RNA存在與否，就可以用于判斷細菌是否存活[10]。另外，在同種微生物的不同狀態之間或者在不同微生物之間，總是會存在著一些差異基因，因此可以通過提取細菌細胞中的總RNA后，再采用一些核酸分子擴增技術（如RT-qPCR技術）對這些差異基因進行定量檢測，用來判斷VBNC狀態的信使RNA的相對表達程度，從而能夠準確評價VBNC狀態細菌對人類健康和食品衛生存在的潛在威脅。Liu Y等人[11]利用逆轉錄PCR與實時定量PCR相結合的技術對處于活而非可培養狀態的E.coli O157∶H7進行研究，結果發現活的不可培養狀態的細胞中存在1/10的細胞中含有拷貝rpoS mRNA，實現了定量檢測活的不可培養狀態的細菌。若能找到表達較為穩定的參照基因，也能實現對處于不同狀態的細胞（如可培養狀態細胞、不可培養狀態的細胞及死細胞等）進行定量的檢測。

2.2 免疫學法

免疫學的方法是利用抗原與抗體的特異性結合來對活的不可培養狀態的細菌進行檢測的一種方法。能夠利用免疫學方法對其進行檢測是由于處于活的不可培養狀態細菌的細胞壁表面仍然存在和正常狀態的細菌相同抗原，可以與相對應的特異性抗體結合，從而能夠完成免疫反應[12]，故可以將免疫學法與熒光染色法結合，實現對活、死細胞的檢測，再結合平板計數法（PC法）檢測出具有可培養能力的細胞的數量，快速檢測出活的不可培養狀態細菌。免疫學法常用的有間接免疫熒光法（IF） 和酶聯免疫吸附法（ELISA）。這2種方法各有優缺點，間接免疫熒光法具備耗時短、檢出限低、靈敏度高及在熒光顯微鏡下可直接觀察到細菌菌體完好無損細胞膜的特點；酶聯免疫吸附法則具有操作簡單、特異性識別的能力強和抗干擾能力強等特點。間接免疫熒光法和酶聯免疫吸附法常用來檢測細菌的總菌數，然后再聯合異養菌平板計數法（HPC法）和熒光染色法得出活的不可培養狀態細菌數。

2.3 光學法

光學方法主要是使用熒光顯微鏡將樣品用熒光染料染色后進行鏡檢，現在常用的是活菌鏡檢直接計數法（DVC法）。

在1979年，由Kogure K等人[13]首次提出了活菌鏡檢直接計數法（DVC法），能將活菌與死菌快速區分開，至今仍然是一種實驗室常用的方法。在培養基中，有活性的細菌依然能夠吸收營養物質，故DVC法就是在培養基中加入萘啶酮酸與細菌細胞中的DNA發生交聯作用來抑制細胞中DNA的合成，從而使活細胞失去分裂能力；在適當溫度下培養6 h后，細菌菌體會增大變粗，然后再用吖啶橙熒光染料染色法進行染色，即可在倒置熒光顯微鏡下觀察到伸長變粗的細菌菌體即為有活性的細菌細胞，將活細胞與死細胞區分開來。但活菌鏡檢直接計數法中所加的DNA合成抑制劑（萘啶酮酸）只能抑制大多數G-菌株的DNA合成，而對大多數G+菌株及少量的G-菌株無能為力，一些比較重要的食源性致病菌中也有G+菌株，如Listeria monocytogenes、Clostridium botulinum、Bacillus cereus及 Staphylococcus aureus等。故有研究表明，將活菌鏡檢直接計數法中的核酸抑制劑萘啶酮酸使用氧氟沙星或者環丙沙星代替，同時用10%的大豆蛋白胨代替酵母膏，能夠有效抑制大多數G+菌株和G-菌株DNA合成，從而擴展傳統活菌鏡檢直接計數法的檢測范圍[14]。在活菌鏡檢直接計數法中除了能夠添加一些常見的DNA抑制劑外，還可以添加一些電子受體絡合物（CTC）進行鏡檢。無色氧化態的CTC可以透過細胞膜，進入活細胞中參與細胞內的氧化還原反應，從而被還原成紅色或者紫色，故DVC-CTC法就是利用活菌還具有氧化還原能力，加入CTC后可以在熒光顯微鏡下進行活菌直接計數。有研究報道，DVC-CTC法所能夠檢測的活菌數比原始的活菌鏡檢直接計數法高出1～2個數量級，故DVC-CTC法相比于原始的活菌鏡檢直接計數法來說具有更高的準確性[15]。

2.4 其他方法

目前還有其他的一些檢測方法能夠用于活的不可培養狀態的細菌檢測，如流式細胞儀檢測、同位素標記法、酶分析、基因芯片檢測、DNA指紋圖譜技術及多種方法相結合的綜合應用檢測等[16]。

3 結語

民以食為天，食以安為先。有關食源性致病菌活的不可培養狀態的發現和研究，對于微生物學、公共衛生學、預防醫學和食品衛生檢驗等方面都有重要意義，特別是對提高食品安全性、保障人體的健康有重要意義?；畹牟豢膳囵B狀態細菌的存在給食品安全帶來了潛在的威脅，解決這一威脅的根本辦法就是建立針對VBNC狀態細菌的快速檢測方法及完善的檢測機制。隨著科學水平的不斷發展，人們會對VBNC狀態研究越來越多，各種先進的儀器設備也會幫助人們更加深入地了解VBNC狀態形成的分子機制。在以后的研究中通過轉錄組學和蛋白組學的聯合分析，研究VBNC狀態形成機制和復蘇機制可能是未來食源性致病菌VBNC狀態研究的一個熱點。