利用高通量測序技術對水稻秸稈中、低溫降解菌系的比較分析

班允赫， 李 旭， 李新宇， 王秀娟， 蘇振成 ， 張惠文

(中國科學院 沈陽應用生態研究所污染生態與環境工程重點實驗室，遼寧 沈陽 110164)

作為一種豐富的可再生木質纖維素生物質資源，全球每年產生約5.1×109噸的農業殘留物[1-2]，是目前僅次于煤炭、石油以及天然氣的第四大能源[3]。但只有其中一小部分被用于堆肥、飼料或生物燃料生產，大部分被遺棄在田間或焚燒[4]，造成極大的資源浪費和嚴重的環境污染。據不完全統計，我國每年農作物秸稈產量占世界總產量的28.1%[5]，但秸稈利用方式單一、利用效率低、大面積燒荒等會帶來突出的環境問題[6]。為此，2015年國家農業部明確了“一控、兩減、三基本”政策目標，秸稈還田就此成為秸稈資源化利用的主要方式之一[7]。秸稈在自然環境下較難降解[8]，所含木質纖維素生物轉化過程受溫度、濕度和土壤含水量等多種因素影響，特別是其化學成分(纖維素、半纖維素和木質素)在非共價鍵和共價鍵交聯作用下緊密結合[9]，因此木質纖維素水解是秸稈資源利用最重要的技術和經濟限制。木質纖維素降解菌是農業生態系統中重要組成部分，是土壤有機質和養分循環的主要驅動力。在纖維素生物質資源化利用中，獲得高效纖維素降解菌種尤為重要。在自然界中，木質纖維素的完全降解是真菌、細菌及相應微生物群落共同作用的結果。真菌在木質纖維素降解過程中起著主導作用，在陸地生態系統中的大多數真菌分布在壺菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)中，其中許多真菌，如曲霉屬(Aspergillus)、毛殼菌屬(Chaetomium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐霉屬(Pythium)、青霉菌屬(Penicillium)和木霉菌屬(Trichoderma)均是傳統的木質纖維素降解酶的生產者，具有好氧降解纖維素的能力。在纖維素降解真菌中，白腐真菌和褐腐真菌被認為是木質纖維素材料最普遍和最有效的分解者。然而，木質纖維素的頑固性以及真菌產酶量不足仍然限制了真菌在木質纖維素降解過程中的應用。特別是在水田系統中，因為絕大多數真菌為好氧微生物，在厭氧或兼性厭氧條件下，真菌不能進行正常的生命代謝活動，因此真菌在稻田土壤環境中的應用受到了較大限制。除真菌外，細菌因其多功能性和功能多樣性而被大力研發，并作為在未來應用領域中良好的戰略資源。與真菌相比，細菌能利用的碳源種類較為復雜，在木質纖維素分解過程中能更快的增殖和代謝，酶產量更高。同時，細菌還具有對溫度、pH值和鹽度等環境因素較強的耐受能力，可以代謝產生在中性或堿性范圍內具有木質纖維素降解活性的酶。細菌代謝產生的木質纖維素降解酶的復雜性更高，這種復合酶系更適合復雜、連續的木質纖維素降解生物轉化過程。此外，與真菌相比，利用分子技術構建細菌產酶的表達系統的方法更多樣、技術難度更小。從自然生境中富集馴化，是一種獲得纖維素降解菌種資源的重要方式。在自然條件下，秸稈的有效生物轉化很大程度上取決于多種微生物群落協同作用，而非單一菌株[10]。純培養的纖維素降解菌易受環境或生物因素影響，在實際應用中效果并不理想。為此秸稈降解菌系的概念被提出，并逐漸成為研究熱點之一[11-13]。秸稈降解菌系中包含環境中多種微生物，具有抗脅迫能力強、協同作用好等優點。但是，正由于所含微生物種類豐富，在降解菌系的富集馴化過程中，細菌多樣性易受微生物源、可用底物、pH、氧化還原電位以及溫度等因素影響[14-15]，從而引起降解菌系群落多樣性發生改變[16-18]。例如，溫度是秸稈降解的重要影響因素，決定了微生物演替中的各種生物過程[19]，在低溫脅迫下，嗜中溫纖維素降解微生物的代謝受到強烈影響，而嗜冷纖維素降解微生物能夠較好生長，發揮降解作用。目前，國內外主要集中在中、高溫秸稈降解菌的研究和開發，而對纖維素低溫降解的研究相對較少[20]。但是，北方地區特別是黑、吉、遼三省是我國水稻、玉米等糧食作物的重要產區之一，每年有大量作物秸稈遺留田間。由于秋冬季氣溫低，時間長，導致作物秸稈降解十分緩慢，甚至不能完全降解，對土壤、次年整地和播種都會產生不利影響。目前，秸稈降解菌的研究主要集中在中高溫或者常溫條件下，這些菌株不適合在北方地區條件下應用，且由于低溫纖維素降解菌不易篩得，因此有關的研究鮮有報道[21-23]。因此，研發低溫條件下高效快速分解作物秸稈菌劑是推進北方地區秸稈還田的重要措施。此外，由于秸稈降解菌系結構復雜，很難通過傳統培養方法分析復雜的微生物菌系，其中關鍵微生物往往會被遺漏掉[24]。將高通量測序技術應用于木質纖維素降解菌系的檢測，使得復雜微生物菌系組成得到了表征[25-27]。本研究采用高通量測序技術，分析了5對(10個)不同來源秸稈降解菌系在中、低溫條件下富集馴化后的細菌群落結構特征，探討溫度變化對秸稈降解菌系群落結構的影響，為構建高效穩定的秸稈降解菌系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2016年11月，在東北三省采集水稻秸稈樣本52個；2017年1月，在長江中下游地區采集水稻秸稈樣本48個。將每個秸稈樣本置于無菌塑料袋中密封后，在低溫、避光條件下送至實驗室。

1.1.2 培養基 篩選培養基：K2HPO41.0 g，NaNO31.0 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，丙酮酸鈉0.3 g，蛋白胨0.5 g，(NH4)2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，酵母浸出粉0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，D-山梨醇0.5 g，蒸餾水1 000 mL，添加SL10微量元素液和鈣溶液終濃度均為0.1%。SL10微量元素液：ZnSO4·7H2O 1.5 g，CoCl2·6H2O 0.15 g，Na2MoO4·2H2O 0.1 g，MnSO4·H2O 1.5 g，CuSO4·5H2O 0.15 g，H3BO30.3 g，NiCl2·6H2O 0.06 g，KI 0.06 g，蒸餾水1 000 mL。鈣溶液：3% CaCl2溶液。在250 mL三角瓶中加入100 mL篩選培養基，再加入2條1 cm×5 cm的新華濾紙作為指示物，滅菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 降解菌系的富集及馴化 無菌條件下，將秸稈樣本剪成5 cm小段，浸沒于滅菌篩選培養基中，25 ℃靜置培養若干天，待濾紙條完全崩解后，將5%菌懸液(體積分數)轉移至新的培養基中，在相同條件下培養。繼代15次后，得到5個均能在15 d內完全降解濾紙條的菌系。在繼代培養的同時，將這5個降解菌系進行低溫馴化，即在每次傳代后，培養溫度降低1 ℃，經過15次繼代培養后，得到5個低溫降解菌系，在10 ℃條件下能于20 d內將濾紙條完全崩解。所得的降解菌系對應秸稈樣品信息，如表1所示。

表1 樣品采集及富集馴化信息表

1.2.2 DNA提取、PCR擴增及Miseq測序 采用Fast DNATMSpin Kit for Soil土壤DNA提取試劑盒(Cat.No.116560-200; Mpbio Company, USA)提取降解菌系全基因組DNA，方法如下：取2 mL降解菌系發酵液至無菌離心管中，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心5 min，棄去上清液，所得沉淀用于降解菌系全基因組的提取。分別利用1%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophorsis, AGE)和NanoDrop 2000微量分光光度計(Thermo Scientific, USA)檢驗提取所得降解菌系全基因組DNA的質量、濃度和純度。所得DNA樣品-20 ℃保存備用。以上述DNA為模板，用引物[28]515F Modified(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R Modified(5′-GGACTACNVGGGTWT-CTAAT-3′)，采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)對降解菌系16S rRNA的V3～V4區進行特異性擴增。反應體系如下：在20 μL反應體系中，加入10 ng DNA模板，2.5 mmol/L dNTP，前、后引物各0.4 μL，4 μL PCR緩沖液以及0.4 μL FastPfu 聚合酶。DNA擴增條件[29]：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。分別利用1%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophorsis, AGE)和NanoDrop 2000微量分光光度計(Thermo Scientific, USA)檢驗PCR產物的質量、濃度和純度后，將樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司(Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd, Shanghai, China)，利用Illumina Miseq(Illumina Miseq PE250, USA)對擴增子進行高通量測序。

1.2.3 高通量測序及生物信息學分析 使用Usearch軟件平臺(vsesion 7.0 http://drive5.com/usearch/)對優化序列提取非重復序列，降低分析中間過程冗余計算量，去除沒有重復的單序列，按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU(Operational taxonomic unit)聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。采用RDP classifier(version2.2 http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。將序列與Silva基因數據庫(Release128 http://www.arb-silva.de)進行比對，設置置信閾值0.7，對每個樣品的16S rRNA基因序列進行分類分析。

1.2.4 生態學及統計學分析 利用Mothur (version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)軟件計算樣品的α多樣性指數，其中包括群落豐富度指數(ACE、 Chao1、 Sobs)和群落多樣性指數(Shannon, Simpson)。利用各樣本在不同測序深度時的微生物α多樣性指數構建稀釋曲線(Rarefaction curve)，反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。利用Venn圖統計中、低溫秸稈降解菌系樣本中所共有和獨有物種及其數目，并分析其組成相似性及重疊情況。通過群落Bar圖分析各個樣本在不同分類學水平上的微生物種類、相對豐度，并對樣本在各分類水平上群落組成的相似和差異程度進行量化分析。

1.2.5 降解菌系對秸稈降解效率測定 供試秸稈于2018年10月采集于中國科學院沈陽應用生態研究所遼寧沈陽農業生態系統國家野外科學觀測站，水稻品種為美鋒9號。水稻收獲后，采集其地上部分，粉碎成2～3 cm長的小段。供試水稻秸稈基本化學組成見表2。準確稱取3.00 g供試秸稈，置于裝有篩選培養基的250 mL三角瓶中，每個三角瓶裝樣量為100 mL。用封口膜密封后，121 ℃高溫滅菌20 min，冷卻備用。將降解菌系菌懸液以5%(體積分數)接種至三角瓶中，中、低溫降解菌系分別于25 ℃和10 ℃條件下培養，分別在4和8周測其降解率，每個處理設置3次重復。

表2 水稻秸稈基本化學組成

2 結果與分析

2.1 中、低溫秸稈降解菌系的α多樣性分析

對10個中、低溫秸稈降解菌系樣本16S rDNA的V3～V4區進行高通量測序，經質量控制并去除嵌合體后，獲得601 489條高質量序列，平均長度為273 bp。測序群落覆蓋指數達0.999以上(表3)，說明結果可以反映所測樣本細菌群落組成的真實情況。

表3 中、低溫秸稈降解菌系的α多樣性指數表

根據所有樣本最小序列抽平，以97%的序列相似性對OTU進行聚類分析，基于OTU數和相對豐度計算不同秸稈降解菌系Shannon指數在2.04～3.23之間(表3)。其中，中溫菌系HD10最高，中溫菌系Z36最低，各菌系OTU稀釋性曲線均趨平(圖1)。

α多樣性指數是用于表征某個指定區域或特殊生境中的物種多樣性，通常用Shannon指數和Simpson指數來評價微生物物種的多樣性。Shannon指數值越高，物種多樣性越豐富，Simpson指數值越高，物種多樣性越少。通過計算α多樣性指數，發現中溫秸稈降解菌系多樣性指數顯著高于低溫秸稈降解菌系(P<0.05，下同)，但對菌系Z36而言，低溫菌系多樣性高于中溫菌系。

圖1 中、低溫秸稈降解菌系OTU水平Shannon指數稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of OTU level of medium-and low-temperature straw-decomposing microbial consortia measured by Shannon index

2.2 中、低溫秸稈降解菌系群落組成分析

對測得的基因序列進行分類，發現5對秸稈降解菌系中所含細菌共可分為18個門、28個綱、55個目、97個科、188個屬、238個種、333個OTU。其中，中溫菌系有18個門、27個綱、51個目、92個科、172個屬、220個種、302個OTU；低溫菌系有16個門、25個綱、50個目、87個科、169個屬、208個種、280個OTU。

如圖2a所示，中溫菌系特有屬為19個，低溫菌系特有屬為16個，其共有屬為153個。共有屬(圖2b)中弓形桿菌屬(Arcobacter)相對豐度為34.18%，屠場桿菌屬(Macellibacteroides)、擬桿菌屬(Bacteroides)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和叢毛單胞屬(Comamonas)相對豐度分別為9.22%、9.04%、5.26%和4.58%。中溫菌系特有屬(圖2c)中Izimaplasmatales屬的相對豐度為25.23%、類香菌屬(Myroides)相對豐度為20.39%，Phycisphaerae屬、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和Proteocatella屬的相對豐度分別為9.21%、7.40%和7.25%。低溫菌系特有屬(圖2d)中梭菌屬(Clostridium)的相對豐度為12.24%，豐佑菌屬(Opitutus)、脫硫芽胞彎曲菌屬(Desulfosporosinus)、腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)和Marinilabiliaceae的相對豐度分別為9.33%、7.58%、7.58%和5.25%。

5對秸稈降解菌系中5個優勢菌門(圖3a)為Epsilonbacteraeota、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Fimicutes)和纖維桿菌門(Fibrobacteres)。其中Epsilonbacteraeota的豐度最高，占每個樣本16S rRNA序列總數的24.69%～52.35%。其次是擬桿菌門，占每個樣本16S rRNA序列總數的21.97%～40.89%。在屬水平上，10個秸稈降解菌系包括188個屬(圖3b)。其中，中溫菌系172個屬，低溫菌系169個屬。中、低溫降解菌系最高的5個優勢菌屬按豐度降序排列，見表4。

圖2 中、低溫秸稈降解菌系物種Venn圖(a)及其共有屬(b)、特有屬(c)、(d)相對豐度Fig.2 Unique and shared present in two group microbial consortia. (a) Venn diagram showing the unique and shared genus from medium-and low-temperature straw-degrading microbial consortia. (b) Shared genus and their abundance distribution of the medium-and low-temperature microbial consortia. Medium-and low-temperature only genus and their abundance in (c) and (d), respectively

表4 中、低溫秸稈降解菌系優勢菌屬及相對豐度

中溫降解菌系中5個優勢菌屬分別為弓形桿菌屬、擬桿菌屬、屠場桿菌屬、假單胞菌屬和梭形桿菌屬(Lysinibacillus)；低溫降解菌系中5個優勢菌屬分別為弓形桿菌屬、屠場桿菌屬、擬桿菌屬、叢毛單胞屬和假單胞菌屬。在屬水平上，已知有纖維素降解功能的纖維桿菌屬(Fibrobacter)分別只占中、低溫秸稈降解菌系相對豐度的1.56%和2.40%。

中、低溫秸稈降解菌系優勢菌門的相對豐度沒有顯著差異(圖4a)，但在屬水平上，低溫菌系中屠場桿菌屬的相對豐度顯著高于中溫菌系(圖4b)。另一方面，雖然經中、低溫富集馴化后，5對秸稈降解菌系在整體水平上只有屠場桿菌屬的相對豐度有顯著性差異，但對樣本中相對豐度排序前20的菌屬進行分析發現，其相對豐度差異均呈顯著或極顯著(圖5，P<0.01，下同)。結果說明，在個體水平上，溫度是影響菌系組成極為重要的因素。

2.3 中、低溫降解菌系對秸稈降解效率比較

在分析群落組成的同時，測定了中、低溫降解菌系對水稻秸稈的降解效率，結果如圖6所示。

與對照組相比，中、低溫降解菌系均能在試驗第1和第2個月顯著提高秸稈的降解率。第1個月(圖6a)，除菌系Z36外，各中溫菌系對秸稈的降解效率均顯著高于低溫菌系。中溫菌系F對秸稈的降解效率達到34.29%，為所有菌系最高，且顯著高于菌系D1108和菌系Z36。各低溫菌系對秸稈的降解率為20.33%～23.20%，差異不顯著。第2個月(圖6b)，中溫菌系F對秸稈的降解效率為64.24%，顯著高于菌系HD10。各低溫菌系對秸稈的降解率為37.95%～43.67%，無顯著差異。

圖3 中、低溫秸稈降解菌系在門(a)、屬(b)水平相對豐度Fig.3 The relative abundance of medium-and low-temperature straw-decomposing microbial consortia in phylum(a) and genus(b) 相對豐度不足1%的門或屬合并為“其他”Less than 1% abundance of the phylum or genus was merged into others

圖4 中、低溫秸稈降解菌系微生物群落相對豐度在優勢菌門(a)、屬(b)的統計學比較Fig.4 Statistical comparison of the relative abundance of medium-and low-temperature straw-decomposing microbial consortia in the dominant phylum(a) and genus(b) *相關系數在P<0.05時顯著 *P<0.05 was considered statistically significant

圖5 中、低溫秸稈降解菌系微生物群落相對豐度在屬水平上的統計學比較Fig.5 Statistical comparison of the relative abundance of medium-and low-temperature straw-decomposing microbial consortia in genus level *相關系數在P<0.05時顯著；**相關系數在P<0.01時顯著；***相關系數在P<0.001時顯著，下圖同*The correlations are significant at P<0.05， **The correlations are significant at P<0.01，***The correlations are significant at P<0.001，same the figure

圖6 中、低溫秸稈降解菌系在第1(a)、第2(b)個月對秸稈降解效率的比較Fig.6 Comparison of the straw degradation rates of medium-and low-temperature straw-decomposing mircobial (consortia in the first(a) and the second(b) month)

3 討 論

目前，針對秸稈降解菌所進行的研究多是共生性菌系，其功能與群落組成密切相關[30]。菌系培養溫度往往會影響菌群的結構、活性及菌群中某些微生物的數量[31-32]。因此，溫度是影響微生物菌系群落多樣性的重要因素[32-35]。本研究對比了中、低溫降解菌系群落多樣性、群落結構和相對豐度，其結果表明溫度對降解菌系組成有顯著影響，當溫度變化時，微生物群落結構也會產生較大變化。

通過計算α多樣性指數，發現中溫秸稈降解菌系多樣性指數顯著高于低溫秸稈降解菌系，但菌系Z36例外，其低溫菌系群落多樣性高于中溫菌系。這可能與其采樣地點相關，菌系Z36采自黑龍江省黑河市訥河，緯度高、冬季氣溫低、凍土期較長，菌系Z36中耐冷、嗜冷微生物種類較多，在低溫條件下表現出較高的群落多樣性。

經國內外多年研究發現，已知具有纖維素分解功能細菌主要分布在厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門[36]。在厚壁菌門中，備受關注的纖維素降解菌分布在梭菌綱(Clostridia)和芽胞桿菌綱(Bacilli)。梭菌屬中大量菌種(株)具有分解木質纖維素能力，通常是建立復合菌系的關鍵菌[37]，其中C.thermocellum是最早分離，且纖維素分解能力較強的一類梭菌[38]。芽胞桿菌屬(Bacillus)和類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)是芽胞桿菌綱中具有大量纖維素降解菌的兩個屬，已廣泛應用于工業產酶，其具有較高的熱穩定性和廣泛的pH適應性[39]。在變形菌門中，假單胞菌屬在自然界中普遍存在，該菌屬中的P.mendocina具有較強纖維素分解能力[40]。在擬桿菌門中，噬細胞菌屬(Cytophaga)是土壤中普遍存在的一種好氧屬，哈氏噬纖維菌(C.hutchinsonii)能利用濾紙作為唯一碳源生長，具有降解結晶纖維素的能力[41]。此外，噬幾丁質菌屬(Chitinophaga)也是擬桿菌門中的重要菌屬，C.pinensis具有降解植物甘露聚糖的能力[42]。在本研究富集馴化所得降解菌系中，除了已知具有纖維素降解功能的纖維桿菌屬外，也包含上述部分菌屬，但是否為文獻中已報道的菌種(株)，未可知。

在秸稈降解菌系的研究過程中，建立復合菌系所用菌株一般為具有纖維素降解能力的功能菌，以及具有輔助代謝功能的輔助菌。某些輔助菌，如叢毛單胞菌屬，假單胞菌屬中的部分菌種(株)，雖然不具有纖維素降解能力，但能以降解菌分解纖維素所得產物及其次級代謝產物為底物進行代謝，降低降解菌的反饋調節，加快代謝產物消耗，從而起到“減毒”和“增效”的作用，這些輔助菌在秸稈降解菌系的構建中十分關鍵。

一種高效穩定的降解菌系在降解秸稈過程中，其關鍵菌種(株)的數量比例是呈規律性變化的[43]，菌種(株)之間復雜的協同關系使菌系結構保持相對的穩定[44]，但在限制性培養過程中，菌群結構卻一直處于動態變化。在此過程中，可以通過改變菌系的培養條件，使其菌群結構向需要的方向發生改變，這也是一種獲得纖維素降解菌系的重要方法。已有的研究報告中顯示，低溫秸稈降解菌系大多是通過采集長期處于高海拔、低溫地區的環境樣本，經低溫篩選所得。但是，該種方法所用的樣本因環境條件限制而不易采集，且低溫富集周期普遍較長，所以采用該種方法獲得低溫秸稈降解菌系較為困難。相反，若先篩選獲得中溫秸稈降解菌系，而后在繼代培養的同時，逐步降低培養溫度，使其在保持纖維素降解能力的同時，逐漸適應低溫環境。如此，經溫度梯度馴化來獲得低溫降解菌系，也不失為一種行之有效的方法。