希瓦氏菌生物被膜研究進展

閻 俊， 謝 晶,3,4*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.農業農村部 水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306；3.上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，上海 201306；4.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海 201306)

希瓦氏菌(Shewanellaspp.)是一種嗜冷性運動革蘭陰性桿菌，是海產品中常見的腐敗菌，在低溫環境下，該菌能夠將水生動物和高蛋白食品中的氧化三甲胺(Trimethylamine oxide,TMAO)還原為三甲胺(Trimethylamine,TMA)，產生氨類及H2S等腐敗腥臭味的氣體物質，腐敗能力強[1]。因此，希瓦氏菌是評估海產品品質的重要微生物指標[2]。希瓦氏菌也是各種水生生物的條件致病菌[3-4]和人類潛在的病原體[5-6]。生物被膜是微生物附著在生物或者非生物固體表面后分泌胞外基質，并將微生物自身包裹于胞外基質中形成的復雜、異質的多細胞群落[7-9]，它無處不在。生物被膜的胞外基質主要由胞外多糖、胞外蛋白和胞外DNA(eDNA)組成。生物被膜的形成增強了細菌在自然界的抗逆能力，并難以清除和殺滅[10]，是細菌適應外在環境變化的生存模式。腐敗菌和致病菌在食品加工設備表面一旦形成生物被膜，就難以清除，會形成持續的污染源,對人類健康和工業生產造成危害。希瓦氏菌易黏附于物體表面形成生物被膜[11]，而加工環境中的生物被膜容易被忽視，形成持續污染源，造成二次污染和交叉污染，產生食品腐敗和食品安全問題，這不僅對經濟發展造成不良影響，也對人類的身體健康產生極大威脅。因此，抑制生

物被膜的形成并對其進行有效的控制是目前亟需解決的問題。本文對希瓦氏菌生物被膜的形成過程、形成機制、控制方法等進行綜述，以期為希瓦氏菌生物被膜的深入研究提供參考。

1 生物被膜的形成

生物被膜的形成是一個動態過程，主要分為4個階段：細菌的初始黏附、微菌落形成、生物被膜成熟和生物被膜的消解(圖1)。

1.1 細菌的初始黏附

浮游態細菌感知并黏附在物體表面，開始進入初始黏附階段，這個階段根據細菌與表面結合的強弱，分為可逆黏附和不可逆黏附，不可逆黏附是細菌從浮游態向生物被膜態轉換的關鍵，對于生物被膜的形成至關重要。

當細菌細胞與黏附表面足夠接近并允許進行初始黏附時，在范德華力、靜電力、疏水作用力下產生黏附。此時，細菌細胞做布朗運動，可以被流體剪切力輕易除去，此時為可逆黏附階段。隨后，細菌通過分泌胞外多糖或與特異性配體如鞭毛、菌毛結合，由可逆黏附轉變為不可逆黏附。不可逆黏附只有通過刮、擦或化學清潔劑等強力的物理或化學手段才可清除。在從可逆黏附到不可逆黏附的過渡中，涉及到各種短程作用力，包括共價鍵、氫鍵以及疏水鍵的相互作用，此外，菌體表面的細胞元件及細胞分泌物對黏附的形成都發揮著重要的作用[13-14]。當完成可逆黏附向不可逆黏附的轉變后，開始了生物被膜的生命周期。

圖1 生物被膜形成周期[12]Fig.1 The formation cycle of biofilm[12]

1.2 微菌落的形成

細菌完成初始黏附后迅速增殖，同時開始調整基因的表達，分泌大量胞外物質使細菌聚集，黏附在宿主表面形成微菌落，微菌落一般含有50～100個左右的菌體細胞，是生物被膜的早期形態，其形成是一個相對短暫的階段，是菌體從不可逆黏附階段進入生物被膜成熟階段的過渡期，也是菌體形成成熟生物被膜所必須經歷的過程[12]。

1.3 生物被膜的成熟

隨著微菌落中菌體的生長繁殖和更多的胞外基質被分泌，生物被膜逐漸成熟，生物被膜基質的成分也越來越復雜，成熟的生物被膜中菌體細胞只占生物被膜總干重的10%，90%均為胞外基質[7]。胞外多糖和蛋白是構成生物被膜的主要成分，eDNA作為補充成分進行填充[15-18],三者通過短程作用力相互作用，從而形成生物被膜的三維結構[19]。

1.4 生物被膜的消解

生物被膜一旦形成就必須完成整個生命周期才能恢復浮游狀態。生物被膜的消解是指生物被膜成熟后，在營養物質缺乏等條件的壓力下[12]主動釋放生物被膜中的細菌，使其恢復浮游狀態的過程。浮游狀態的細菌在新的位置開始黏附、增殖并成熟[20-21]，重新開始一個新的周期。

2 希瓦氏菌生物被膜形成機制

微生物的浮游態和被膜態是微生物生存的兩種不同方式，兩種狀態之間的轉變受到微生物嚴格的調控，以適應環境的變化。隨著對希瓦氏菌生物被膜研究的不斷深入，多種生物被膜體外研究模型系統已經建立，在已經完成的諸多希瓦氏菌表型研究的基礎上，越來越多的學者開始關注希瓦氏菌生物被膜形成機制的研究。

Theunissen等[22]對Shewanellaoneidensis進行了隨機轉座子插入突變研究，以期發現有助于S.oneidensis在物體表面聚集并形成生物被膜的基因，通過對生物被膜表型破壞最嚴重的突變株的研究，發現了1個285 kDa的多區域蛋白，其對生物被膜的形成至關重要，并將其命名為生物被膜形成促進因子(biofilm-promoting factor A,BpfA)，該蛋白通過Ⅰ型分泌系統分泌到細胞表面，依賴于BpfA的生物被膜形成表型，受到低濃度鈣離子的正向調控。

Zhou等[23]通過對模式菌株S.oneidensisMR-1的生物被膜形成的分子機制的深入研究，同樣發現BpfA促進了S.oneidensis的不可逆黏附，與LapA促進熒光假單胞菌P.fluorescens的不可逆黏附作用類似[24]，并首次對BpfA、BpfG和BpfD 三個關鍵蛋白進行了詳細的研究，闡明了三種蛋白的具體作用。BpfA作為分子“膠水”直接參與生物膜的形成，BpfG不僅是生物膜形成過程中協調BpfA分泌必不可少的物質，而且還是將BpfA轉化為生物膜釋放的活性物質。BpfD通過與BpfA和BpfG相互作用來調控生物膜的發育，并可能響應信號分子c-di-GMP。此外，BpfD和BpfG的化學計量比對生物膜的形成也至關重要。

這些研究強調了BpfA對希瓦氏菌生物被膜形成的重要性，隨著研究的進一步深入，發現BpfA的分泌受到第二信使環二鳥苷酸(c-di-GMP)的調控。c-di-GMP于1987年首次被發現[25]，其在細菌中普遍存在，可以調控細菌的多種表型[26-28]。c-di-GMP被認為是革蘭陰性細菌浮游態和被膜態轉換的開關，胞內c-di-GMP含量較高時，菌體以生物被膜狀態生存；胞內c-di-GMP含量較低時，菌體以浮游態生存[29-30]。

c-di-GMP在生物被膜形成的4個階段都發揮了作用[26]。在初始黏附階段，c-di-GMP通過調控鞭毛合成和鞭毛轉速控制菌體與物體表面接觸，通過表達促進不可逆起始吸附的細胞元件以及黏附蛋白以幫助菌體黏附在物體表面；通過調控胞外多糖的合成促進微菌落形成和生物被膜的成熟；當胞內c-di-GMP含量下降時，生物被膜開始釋放，菌體通過剪切掉黏附蛋白、抑制胞外多糖的產生、表達運動性相關基因等方式轉化生存狀態，從生物被膜中逃離(圖2)。

因此，諸多學者以c-di-GMP為關鍵物質，對希瓦氏菌生物被膜的形成機制進行了深入研究。通過早期對S.oneidensisMR-1的研究，發現其生物被膜的形成受到c-di-GMP的控制[31-32]，但是對于c-di-GMP的代謝和作用靶點的了解卻很少。Cheng等[33]對BpfA的產生機理進行了研究，發現在有氧條件下，BpfA的表達被一種受氧刺激的環化酶增強。根據之前轉座子誘變的結果鑒定出FlrA是S.putrefaciensCN3中bpfA操縱子的一個關鍵轉錄調控因子，FlrA可以抑制bpfA操縱子的啟動子，而c-di-GMP可以解除FlrA與操縱子的結合。此外還證明了FlhG，一種用于鞭毛合成的輔助蛋白，可以拮抗FlrA對bpfA操縱子表達的抑制。由此可知，FlrA在S.putrefaciensCN32中從c-di-GMP到bpfA相關生物膜形成的信號通路中起著中心調節作用(圖3)，也說明了c-di-GMP在生物被膜形成過程中，對bpfA操作子的調控作用。

在細菌細胞內，兩分子GTP在二鳥苷環化酶(Diguanylate cyclases, DGC)的催化下合成c-di-GMP，DGC具有保守催化位點GGDEF催化合成反應[34]。c-di-GMP的降解則是在磷酸二酯酶(Phosphodiesterases, PDE)的催化下進行的，PDE的保守催化結構域為EAL或HD-GYP。根據DGC和PDE的保守結構域序列，對細菌的基因組進行預測發現，多數細菌能夠編碼DGC和PDE酶[35]。大多數的DGC和PDE的N端(N-terminal domain, NTD)含有信號輸入結構域，能夠感受外界環境信號,從而調控c-di-GMP的生成[36-37]。

圖2 c-di-GMP對生物被膜形成的調控[26]Fig.2 Regulation of biofilm formation by c-di-GMP[26]

圖3 FlrA對bpfA操縱子表達調控示意圖[33]Fig.3 Schematic of the proposed regulation of FlrA on the expression of the bpfA operon[33]

環境因素對于生物被膜的形成有著相當大的影響，正是受到外界環境的刺激，細菌才啟動了浮游態和被膜態之間的相互轉換。然而，介導c-di-GMP調控bpfA操縱子表達的響應因子仍然不清楚。環境因素通過不同的信號轉導途徑影響生物膜的形成。Wu等[38]發現在有氧條件下，二鳥苷酸環化酶DosD的催化作用使環二鳥苷酸(c-di-GMP)水平升高，進而調控bpfA操縱子的表達上調，從而促進有氧生長條件下生物膜的形成。除氧氣外，一氧化氮(NO)可以通過連接到H-NOX結構域介導生物被膜的形成，然而大多數NO感應細菌缺乏含有H-NOX結構域的蛋白質。Nisbett等[39]通過研究發現另一種NO感應蛋白(NosP)可能在許多物種中參與雙組分信號和生物膜調控，通過對S.oneidensis的研究，證明NosP參與了H-NOX/NO感應的多組分c-di-GMP信號網絡。無nosP或順反子激酶nahK的菌株會產生不成熟的生物膜，而hnoX和hnoK(對NO/H-NOX反應的激酶)突變導致野生型生物膜結構發生變化。NosP可以調節NahK和HnoK的自磷酸化活性。HnoK和NahK被證明可以調節三個反應調節因子(HnoB、HnoC和HnoD)，它們共同組成一個NO反應的多組分c-di-GMP信號網絡。NosP/ NahK通過調節HnoK和NahK的磷酸鹽通量來調節c-di-GMP信號網絡，最終調節生物膜的形成。此外，NosP和H-NOX似乎在推拉機制中相互對抗，NosP/NahK通過抑制H-NOX/ HnoK信號促進生物被膜的形成，這本身就降低了生物膜的形成程度。NO主要通過抑制HnoK活性減少c-di-GMP和生物膜的形成。

外界環境中的營養元素對于希瓦氏菌生物被膜形成也起著重要的作用。Liu等[40]通過對S.putrefaciensCN32的研究，發現了三組分負調控生物被膜的系統。該系統包括1個組氨酸激酶LrbS (Sputcn32_0303)和2個同源反應調節因子，包括1個轉錄因子LrbA(Sputcn32_0304)和1個磷酸二酯酶LrbR (Sputcn32_0305)。LrbS響應碳源乳酸鈉的信號，隨后激活LrbA。激活的LrbA促進lrbR的表達，lrbR是另一種反應調節基因。含有EAL結構域的雙(3=-5=)-環二聚物GMP (c-di-GMP)磷酸二酯酶LrbR降低了細胞內c-di-GMP的濃度，從而對生物膜的形成起到了負調控作用。碳源是細菌生長的重要營養物質，其濃度和種類對生物膜的生物量和結構有重要影響。鄧旗等[41]通過添加不同濃度的葡萄糖進行腐敗希瓦氏菌生物被膜的培養，發現葡萄糖對希瓦氏菌生物被膜的形成沒有顯著的影響，這與葡萄糖能夠促進雙歧桿菌生物被膜形成的結論[42]相悖，推測是因為不同細菌生物被膜的形成所依賴的環境因子不同所致。關于營養元素調控生物膜形成機制的認識還很有限，需要進一步發掘研究。

細菌自身的群體感應系統對于生物被膜的形成也有著一定的作用。Wang等[43]通過對大黃魚特異性腐敗菌S.balticaOS155進行自誘導實驗，獲得了細胞密度依賴型的luxR型基因。通過體外結合實驗發現，外源群體感應信號分子cyclo-(L-Pro-LPhe) (PP)與LuxR01及LuxR02蛋白直接相互作用。luxr型基因(luxR01和luxR02)的缺失在不同程度上影響生物膜的形成。通過轉錄分析和qRT-PCR驗證表明，在luxR01和luxR02缺失株中，與生物膜相關的基因tor、speF和pomA下調。此外，外源cyclo-(L-Pro-LPhe)促進了生物膜的形成，而luxR01或luxR02的缺失可以減弱這一效果。微生物往往是處在和其他物種共生的生存環境中，其相互間的互作機制對于生物被膜的形成也有一定影響。Zhu等[44]研究發現，當S.baltica和P.fluorescens混合培養時，生物被膜的生物量少于單菌培養，生物被膜形成過程受到影響，厚度和微菌落數量明顯減少，兩種腐敗菌的無細胞上清液對彼此的生物膜發育有很大的抑制作用。

環境因子的改變是調控生物被膜形成的根本原因。然而，由于環境的復雜多變性以及實驗模擬的局限性，導致對環境因子調控生物被膜形成機制的研究還不夠全面。雖然希瓦氏菌生物被膜形成機制的研究已經引起重視，但相對于其他微生物來說，希瓦氏菌生物被膜形成分子機制的研究還處于起步階段。如果能夠尋找到更多的誘導菌體生物被膜形成的環境因子，揭示這些環境因子調控生物被膜的形成分子機制，將為從源頭控制生物被膜的形成提供參考。

3 希瓦氏菌生物被膜防控方法

希瓦氏菌生物被膜在加工設備表面形成，在一定環境條件下可以造成不銹鋼接觸面的腐蝕[11]，降低設備使用效率和壽命，形成持續的污染源，造成的經濟損失和對健康的威脅也是不可估量的，因此需要采取有效措施控制生物膜的形成，保障水產品的安全。目前，主要通過兩種方法控制希瓦氏菌生物被膜形成，一是改變材料特性抑制微生物的黏附，抑制生物被膜的形成；二是利用物理、化學、生物學方法去除已形成的生物被膜。

3.1 材料改性抑制生物被膜形成

通過改變材料表面的電荷、疏水性、表面粗糙度及形態等性質，抑制微生物的初始黏附，阻斷生物被膜的形成。代悅等[45]采用溶膠凝膠(sol-gel)法和水熱合成法在不銹鋼片表面制備ZnO薄膜，并進行疏水性改善處理，較好地抑制腐敗希瓦氏菌生物被膜的生長。段長平等[46]借助真空條件，采用溶膠-凝膠(sol-gel)法在孔徑約為50 nm的多孔鈦片上制備具有不同微觀形貌的ZnO薄膜并對其微觀結構進行了表征分析，發現具有抑制腐敗希瓦氏菌生物被膜形成的作用。由于多孔鈦片具有疏水性，其抑制希瓦氏菌生物被膜的性能高于普通鈦片且ZnO具有殺菌作用，其對生物被膜的抑制性能增強。通過對不銹鋼表面進行電拋光處理，改變表面粗糙度，使其表面變得平滑，也可以明顯減少附著的細菌細胞，抑制生物被膜的形成[47]。

3.2 希瓦氏菌生物被膜消除手段

對已經形成的生物被膜一般利用物理、化學、生物學方法去除。超聲波技術是最常用的清除表面生物被膜的物理手段，低頻高密度超聲波通過空化作用破壞細菌細胞膜，引起細胞死亡，同時對胞外基質的結構也有一定破壞作用，使部分生物被膜與物體表面剝離，因此具有去除生物被膜的效果[48]。

天然抗菌劑的使用已經在逐步替代商業的化學消毒劑。Zhang等[49]研究發現茶多酚以濃度依賴的方式顯著抑制不銹鋼上的初始細胞附著，茶多酚破壞了生物被膜的胞外聚合物并使得菌體空間結構發生改變。Zhu等[50]從群體感應的角度對茶多酚干擾生物被膜的形成進行了闡述，綠茶多酚通過干擾AI-2和DKPs活性，促進AI-2降解，進而干擾生物被膜的形成，綠茶多酚還可以降低S.baltica的致腐特性。

在食品產業中，使用物理方法中清除生物被膜，對于大量的水產品和農副產品來說，效果不甚理想，而化學方法加入的物質又可能會影響食品的風味和品質，還可能帶來安全隱患，因此采取生物學方法控制生物被膜形成已經逐漸成為首選。

Zhao等[51]認為含有群體感應信號分子的P.fluorescens無細胞上清液對S.baltica的生長、生物膜發育和腐敗能力的抑制，使其穩定期時細胞數量下降，P.fluorescens的無細胞上清液抑制了S.baltica的生物被膜的生成并抑制其腐敗表型。鄧旗等[52-53]研究了抗菌脂肽對S.putrefaciens生物被膜形成的抑制作用。S.putrefaciens在常見的加工接觸面不銹鋼片上可形成成熟的生物被膜，成膜能力較強，在寡營養或消毒劑存在的環境中仍有一定的成膜能力，在與其他腐敗菌共存的體系中也可形成較多的生物被膜，抗菌脂肽能夠有效抑制生物被膜的形成。

以上控制手段都是針對特定微生物在設定的體外模型的條件下進行的，但在實際生產過程中由于微生物的多樣性、環境的復雜性等因素的存在會影響控制效果。此外，食品生產過程的成本計算以及外源添加物對食品風味品質等方面的影響，也是必須考慮的。目前，常采用柵欄技術，將多種技術聯合使用，以達到較好地控制效果。

4 結 語

由于生物被膜形成影響因素的復雜性、體外研究模型的局限性，使得希瓦氏菌生物被膜形成的分子機制尚未完全明確。截止目前，尚無一種方法可以完全控制生物被膜的形成，仍需通過柵欄技術進行組合優化處理。隨著體外研究模型的不斷完善、研究手段的不斷更新，對生物被膜形成機制的研究和控制技術的開發也可以逐步實現。除此之外，實時、快速的檢測技術也有待開發。利用檢測技術并結合消除手段，對黏附在食品加工設備等表面的生物被膜實施靶向、精準、有效清除，對消除持續性污染源，減少生物被膜帶來的風險，具有重要的應用價值。