海藻糖酶產生菌的選育、鑒定及其酶學特性初探

董哲卿， 張新爽， 肖光焰， 董 琦， 郭鴻飛,， 龔勁松， 史勁松， 許正宏

(1. 江南大學生物工程學院 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學藥學院 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江蘇博揚生物制品有限公司，江蘇 南通 226000)

海藻糖(Trehalose)是由2分子吡喃葡萄糖環以α，α-1,1-糖苷鍵連接而成的一種十分穩定的非還原二糖。H.A.Wiggers于1832年在研究黑麥中的麥角菌時，第一個發現了海藻糖；Mitscherlich隨后于1858年在蘑菇中分離到了這種糖，并稱其為海藻糖。海藻糖在自然界中普遍存在，且分布范圍比較廣，包括細菌、真菌、昆蟲、低等植物、脊椎動物，特別在真菌和昆蟲中的含量非常高，是國際上最近開發的主要低聚糖之一[1]。雖然海藻糖的來源廣泛，但能在體內大量積累海藻糖的生物并不是很多。海藻糖的分解途徑在真菌中研究得比較透徹，國內外研究成果表明，除畢赤酵母利用海藻糖磷酸化酶分解海藻糖外，其余所有真菌對海藻糖的分解都是通過以海藻糖為專一底物的海藻糖酶的水解反應實現的。海藻糖酶是一種海藻糖水解酶，能夠專一性并特異性的將1分子海藻糖分解為2分子的葡萄糖。自然界中，海藻糖酶廣泛存在于昆蟲、哺乳動物、微生物和植物中，并發揮著重要的作用；在食品、農業、農藥以及昆蟲處理中應用前景巨大，特別是在乙醇工業中，海藻糖酶可改善發酵糖質原料中二糖組分的利用效率，提高目標產物乙醇的收率，尤其是發酵結束時減小“DP2峰”(DP-聚合度-等同于二糖)海藻糖的總量，可大大提高殘糖的利用率和總糖的轉化率。海藻糖酶最早是Bourquelot于1893年在黑曲霉中發現的，1895年Fischer在釀酒酵母里也發現了海藻糖酶[2]。隨后，科研人員在不同的生物里不斷地發現和鑒定了不同的海藻糖酶，這些生物包括細菌、真菌、昆蟲、線蟲等。真菌中的海藻糖酶因反應的最適pH值差異性被分為兩類：中性海藻糖酶和酸性海藻糖酶。其中酸性海藻糖酶位于液泡，是胞外酶，不能被磷酸化調控，最適pH值在4.5左右；而中性海藻糖酶位于細胞質，負責主要的胞內海藻糖分解，最適pH值在7.0左右。目前有關海藻糖酶產生菌種的報道較少，應用特性也無法滿足生產需求，本研究以經海藻糖馴化的土壤進行產酶菌種的分離選育，并利用形態學和16S rDNA分子生物學鑒定篩選到的目標菌株。通過酶學性質探討在不同條件下目標菌株產海藻糖酶的影響因素和應用性能，以期為海藻糖酶在乙醇生產中的工業化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集 菌種篩選土樣采自無錫長廣溪濕地公園、江南大學附近經海藻糖馴化的土壤。用小鏟子鏟去表層土，采集深5～10 cm處的土壤約50 g，裝入消毒的塑料袋密封并記錄時間、地點、環境情況。

1.1.2 培養基(g/L) ①富集培養基：蛋白胨 5，酵母膏 1.5，葡萄糖 150，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.5。②初篩培養基：海藻糖 15，KCl 1，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO31，瓊脂20，pH 7.0。③液體發酵培養基：海藻糖 15，KCl 1，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO31，pH 7.0。④LB培養基。

1.1.3 酶活測定試劑 ①DNS試劑：準確稱取244.4 g酒石酸鉀鈉于500 mL去離子水中，45 ℃加熱溶解，溶液中加入21 g NaOH，然后加入6.3 g DNS ，溶解后按順序分別加入5 mL苯酚和5 g NaHSO3，待溶液冷卻后定容至1 L。將配制好的DNS溶液于棕色瓶中避光貯存，放置1周后使用。②50 mmol/L H3PO4緩沖液：分別配制200 mmol/L的NaH2PO4和Na2HPO4緩沖液母液(兩者比例分別為68.5%和31.5%)，將母液稀釋配制成50 mmol/L、pH 6.5的PBS緩沖液。③100 mg/mL海藻糖溶液：以50 mmol/L的PBS緩沖液為溶液，加入海藻糖，溶解后配制成10%海藻糖母液，作為酶活測定底物備用。

1.1.4 酶學性質研究試劑 ①BR(Britton-Robinson)緩沖溶液：在100 mL H3PO4、H3BO3和CH3COOH 三種酸(濃度均為 0.04 mol/L)的混合液中，向其中加入不同體積的NaOH(濃度為0.2 mol/L)調節緩沖溶液的pH值為1.8～11.9，10%海藻糖底物溶液由上述緩沖液配制而成，酶液由上述緩沖液進行適度稀釋。②金屬離子溶液：將Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+、Fe2+、Sn2+、Ba2+、Mg2+、Co2+和Li+等各金屬離子配制成濃度為200 mmol/L的母液。

1.2 方法

1.2.1 菌種的富集篩選 取5 g新鮮土樣充分震蕩懸浮于45 g無菌水中，取1 mL土壤懸液上清放入含富集培養基的三角瓶中，37 ℃，220 r/min搖瓶培養24 h。取1 mL經富集培養的菌液移入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，在漩渦震蕩器上震蕩搖勻制成10-1濃度的樣品懸浮液；再從上述懸浮液中吸取1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，震蕩搖勻制成10-2濃度的樣品懸浮液，依次配制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度的樣品懸浮液。各取0.1 mL的樣品懸浮液涂布于初篩培養基上，每個濃度2個重復，選取菌落分散，單菌落數目在100～200左右的平板作為目標平板。復篩時，將菌落接種于液體發酵培養基，37 ℃，220 r/min搖床培養36 h后即得粗酶液，用于酶活測定。根據酶活篩選出具有較高海藻糖酶活力的菌株，待測菌株編號C2。

1.2.2 酶活檢測方法 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定海藻糖酶分解海藻糖產生的葡萄糖含量：取2 mL EP管，依次加入150 μL稀釋后的粗酶液和150 μL 10%的可溶性海藻糖底物做為實驗組；依次加入150 μL稀釋后的酶液和150 μL pH 6.5的磷酸緩沖液，37 ℃反應15 min作為對照組；實驗組和對照組各加入300 μL的DNS試劑，沸水浴5 min終止反應，取出置于冰水混合物中冰浴2 min；取200 μL混合液在540 nm 測定其吸光度值。準確稱取1.0 g干燥至恒重的無水葡萄糖，溶于去離子水中，并定容至100 mL，即為10.0 mg/mL的葡萄糖標準液，按照表1配制不同濃度的葡萄糖溶液，加入300 μL的DNS試劑進行反應，于540 nm測定其吸光度值，制成葡萄糖標準曲線。對照組以pH 6.5的PBS緩沖液代替葡萄糖標準液[4]。酶活計算方法：酶活(1 U)定義為在上述實驗條件下，1 mL的酶液每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量，測定均重復3次。

表1 葡萄糖標準曲線制作

1.2.3 菌種鑒定 收集液體發酵培養基中的菌體，選擇16S rDNA 通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、1492R(GGTTACCTTGTTAC-GACTT)對所提細菌基因組進行PCR擴增，于200 μL PCR管配制50 μL PCR 反應體系。PCR反應體系：ExTaqDNA聚合酶預混液(Takara)25 μL、基因組2 μL、上游引物27F 1 μL、下游引物1492R 1 μL、ddH2O 21 μL，混勻后，稍微離心使溶液完全處于PCR 管底部，將PCR管放入PCR儀，進行PCR擴增。PCR擴增條件：94 ℃ 預變性10 min，95 ℃變性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，重復30次，72 ℃終止延伸10 min，擴增完成后，凝膠電泳檢測PCR 擴增結果。以1×TBE 緩沖液為電泳液，10×Loading buffer染色，5 000 DL DNA Maker 為標準Maker，150 V運行30 min，凝膠成像儀觀察1 500 bp 處有明亮條帶。PCR擴增產物的純化按上海生工生物技術公司的小量膠回收PCR產物純化試劑盒說明進行，使用Thermo NanoDrop 2000 測定所提基因組的濃度，測序由上海睿迪生物科技有限公司完成。利用生化鑒定法(革蘭染色法)對菌種做進一步的鑒定[5-6]，根據微生物實驗手冊對菌株進行革蘭染色，光學顯微鏡和電鏡進行菌體形態觀察[7-8]。

1.2.4 酶學性質研究 ①最適反應溫度研究：用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.5)適度稀釋酶液，分別在30、35、40、45、50、55 ℃條件下測定海藻糖酶酶活，以最高酶活的反應溫度作為最適反應溫度。②溫度穩定性測定：將酶液在不同溫度(30、35、40、45、50、55 ℃)條件下熱處理30 min后置冰上冷卻，按照標準酶活測定方法在37 ℃測定海藻糖酶剩余酶活，以未經處理酶液的酶活作為對照。③最適反應pH值和pH值穩定性研究：在不同緩沖液體系下按照標準酶活測定方法進行酶活檢測，以最高酶活的反應pH值作為最適反應pH值。④pH值穩定性測定：將酶液置于不同pH值緩沖液中并于冰上放置1 h，在標準條件下進行酶活檢測，以未經處理酶液的酶活作為對照。⑤金屬離子對酶活的影響：分別配制200 mmol/L的Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+、Fe2+、Sn2+、Ba2+、Mg2+、Co2+和Li+等金屬離子母液，以1 mmol/L的終濃度分別置入海藻糖酶酶活檢測反應體系，進行標準酶活檢測反應，以不加任何金屬離子的反應作為對照。⑥化學試劑對酶活的影響：分別配制10%吐溫(Tween-20、Tween-80)、曲拉通(Tritonx-100、Tritonx-114)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和二甲基亞砜(DMSO)的溶液，以1%終濃度置入酶活檢測反應體系進行標準酶活檢測反應；將乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)等分別配制成200 mmol/L母液，分別按照1 mmol/L終濃度加入到反應體系后，進行標準酶活檢測反應，以上反應均以不加任何化學試劑作為對照[9-11]。

2 結果與分析

2.1 形態及生理學特性鑒定

將篩選到的菌株C2在LB培養基上劃線培養，菌落圓形、隆起、灰白色，易挑取(圖1)。革蘭染色為紅色，光學顯微鏡觀察，菌體多呈直桿狀，大小在(0.5～1.0)μm×(1.0～3.0)μm左右，單生或成對，有時短鏈狀(圖2)。電鏡觀察進一步確認了該菌株的形態(圖3)。該菌株為革蘭陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性，利用果糖、半乳糖、D-葡萄糖、β-甲基葡萄糖苷和蔗糖產酸?？衫帽猁}、延胡索酸鹽、葡萄糖酸鹽、蘋果酸鹽作為惟一的碳源和能源，不能利用苯甲酸鹽、草酸鹽或丙酸鹽。以終濃2.5%的海藻糖度對該海藻糖酶的全細胞蛋白進行酶活測定，酶活可達17.99 U/mL。

2.2 分子生物學鑒定

菌株C2的16S rDNA序列長度為1 409 bp，在NCBI數據庫中進行核苷酸序列BLAST比對確定其種屬。最終結果顯示，該菌株的16S rDNA序列與Erwinia屬(HM748066.1、MG198678.1等)的相關序列存在99%以上的同源性，與Pantoea屬(KM019845.1)的相關菌株序列同源性為98%左右，最終將其歸為Erwinia屬。結合形態特征和生理生化特性，將其鑒定為大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)，編號為C2，該菌株已保藏在中國普通微生物保藏管理中心(保藏編號CGMCC No.16760)(圖4)。

圖1 菌株C2培養形態Fig.1 Strain morphology of C2 on plates

圖2 菌株C2光學顯微鏡形態(100×)Fig.2 Strain morphology of C2 under light microscope (100×)

圖3 菌株C2電鏡形態Fig.3 Strain morphology of C2 under electron microscope

2.3 海藻糖酶酶學性質研究

2.3.1 最適反應溫度和溫度穩定性 研究發現菌株C2的海藻糖酶的最適反應溫度為40 ℃，在35～45 ℃相對酶活達到90%以上；在30～35 ℃熱穩定性較高，殘余酶活可保持在90%以上，超過40 ℃，熱穩定性明顯下降(圖5)。

2.3.2 最適反應pH值和pH值穩定性研究 在不同緩沖液體系下按照標準酶活測定方法進行酶活檢測，以最高酶活反應的pH值作為最適pH值。研究發現該海藻糖酶的最適pH值為5.0，海藻糖酶在酸性環境下具有較高酶活，尤其在pH值4.5～5.5時，相對酶活仍可達90%以上；pH值穩定性考察結果表明，該酶在pH值為4.0～9.0時均能保持80%以上的殘余酶活，具有良好的穩定性，這一特性應用于乙醇工業生產，可提高殘糖的利用率和總糖的轉化率(圖6)。

2.3.3 金屬離子和化學試劑對海藻糖酶活性影響 金屬離子對酶活影響的研究結果表明，與對照相比，Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+和Fe2+對酶活有促進作用，而Sn2+和Ba2+對酶活有抑制作用，Mg2+、Co2+和Li+對酶活力幾乎沒有影響(表2)。

不同化學試劑，包括表面活性劑、酶抑制劑、金屬螯合劑等對酶活影響的結果顯示，與對照相比，DMSO和DTT對酶活有促進作用，而Triton X-114、SDS和PMSF對酶活有抑制作用，Tween-20、Tween-80、Triton X-100和EDTA對酶活幾乎沒有影響(表3)。

表2 金屬離子對海藻糖酶酶活性的影響

表3 化學試劑對海藻糖酶酶活性的影響

圖4 基于neighbor-joining方法構建大黃歐文氏菌(E. rhapontici)16S rDNA序列系統進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis results based on the 16S rDNA sequence of E. rhapontici based on neighbor-joining method 種屬名稱前的編號為相應基因序列在GenBank中的登錄號，步長值根據1 000次重復計算獲得Numbers before the strain name are accession numbers of published sequences in GenBank， bootstrap values were based on 1 000 replicates

圖5 大黃歐文氏菌(E. rhapontici)海藻糖酶的最適溫度及溫度穩定性Fig.5 Optimum temperature and thermo-stability oftrehalase produced by E. rhapontici

圖6 大黃歐文氏菌(E. rhapontici)海藻糖酶的最適pH及pH穩定性Fig.6 Optimum pH and pH stability of trehalase produced by E. rhapontici

3 討 論

海藻糖酶在食品、工業及農業領域應用廣泛[12-13]，但目前產酶菌以及海藻糖酶酶學特性研究報道較少。特別在工業生產中，海藻糖酶可以改善發酵原料利用效率以提高產物乙醇的收率，能夠大大提高殘糖的利用率和總糖的轉化率。因此，海藻糖酶的菌種選育及酶學性質研究有著潛在的理論意義和實踐價值。本研究在對大黃歐文氏菌海藻糖酶酶學性質進行研究過程中發現，其最適反應條件為40 ℃、pH值5.0，該海藻糖酶在酸性條件下較穩定，35 ℃以下熱穩定性較高；添加金屬離子如Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+和Fe2+以及化學試劑DMSO和DTT對酶活力均有促進作用，Triton X-114、SDS和PMSF對酶活力有抑制作用。

目前，有關海藻糖的相關代謝酶類研究主要是針對海藻糖合成酶并已有大量報道[14-17]，而有關水解海藻糖的海藻糖酶則報道較少，已有的海藻糖酶主要來源于昆蟲，如棉鈴蟲 (Helicoverpaarmigera)[18-19]、小菜蛾(Plutellaxylostella(Linnaeus))[5]、煙粉虱 (Bemisiatabaci)[20]、綠盲蝽 (Apolyguslucorum)[21]等，而微生物來源的海藻糖酶則鮮有報道。

于林港等[22]以大腸埃希菌E.colistr.K-12 substr. MG1655基因組為模板，擴增獲得1種海藻糖酶基因tref，經大腸表達宿主E.coliBL21 (DE3)中重組表達，對重組菌進行發酵優化和IPTG誘導后，重組海藻糖酶的酶活最高達到107 U/mL，該酶的最適反應溫度為50 ℃，最適pH值為7.0。馬俊等[23]以4齡小菜蛾Plutellaxylostella(L.)體內海藻糖酶為研究對象，在離體條件下的研究結果表明，小菜蛾體內海藻糖酶的最適反應pH值為6.0，溫度50 ℃。譚永安等[21]以綠盲蝽膜結合型海藻糖酶 (ALTre-2)基因為研究目標，構建了ALTre-2原核表達載體 (pET28a-ALTre-2)，經IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析顯示該蛋白以包涵體形式存在，經變性、復性后發現重組ALTre-2蛋白在pH值7.0時活性最高，最適反應溫度為50 ℃。Ai等[5]對棉鈴蟲 (H.armigera)海藻糖酶的酶學性質研究結果表明，該酶在最適反應溫度為55 ℃，最適pH值為6.0的條件下，酶活性為1.62 U/mg。于彩虹等[18]對昆蟲組織中海藻糖酶活性測定結果顯示，亞洲玉米螟、棉鈴蟲腸中海藻糖酶的活性最高，分別為316.17和39.35 mU/mg，而甜菜夜蛾體壁中海藻糖酶活性最高達139.99 mU/mg。

本研究從自然界選育獲得1株產海藻糖酶的細菌——大黃歐文氏菌(E.rhapontici)，該酶具有良好的催化活性和操作穩定性。除SDS和PMSF對酶活力有抑制作用以外，其他外界環境因素對酶活性影響較小。截至目前大黃歐文氏菌(E.rhapontici)產海藻糖酶尚未見文獻報道，本研究針對該野生菌產海藻糖酶的特性進行初步探究，可為后續采用基因工程進行海藻糖酶重組表達、分子改造和規?；苽涞妊芯刻峁﹨⒖?。