外切菊粉酶的酶學研究進展

何麗梅， 張 蕊,2,3， 李 娜， 雷 曦， 周峻沛,2,3*

(1．云南師范大學 生命科學學院，云南 昆明 650500；2．生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500；3．云南省高校高原特色食品酶重點實驗室，云南 昆明 650500)

菊粉又稱菊糖，其來源較為廣泛，在植物、海藻、真菌和細菌中都有分布，主要來源于植物[1]。目前已發現含有菊粉的植物大約有3.6萬種，包括單子葉植物的禾本科、百合科、芭蕉科以及雙子葉植物的龍膽科、菊科、桔?？频?1個科，表1中例舉了部分常見植物中菊粉的含量，其中菊芋和菊苣的菊粉含量較高，占其塊莖干重的50%以上，菊芋和菊苣的抗逆性、適應性強，在中國的許多地方都有種植，因此最適宜用來生產菊粉[2]。菊粉是果聚糖的一種，它由D-呋喃果糖經β-2, 1-糖苷鍵毗連而成，其還原端有一個葡萄糖殘基經α-1, 2-糖苷鍵毗連[3]。菊粉的化學結構式為G-1, (2-F-1) n-1,2-F，簡寫GFn，G代表終端葡萄糖單元，F代表果糖單元，n代表果糖的單元數，大多數的菊粉屬于此類結構(圖1)。菊粉是果糖基可再生資源的優質來源，可被菊粉酶分解用于生產果糖、高果糖漿、燃料乙醇、菊粉寡糖等產品。菊粉酶(Inulinase)是一類能夠水解β-2, 1-D果糖苷鍵的水解酶，稱為β-2, 1-D果聚糖酶，也稱作β-果糖苷酶、β-果聚糖水解酶，β-2, 1-D果聚糖水解酶(EC3.2.1)[4]。菊粉酶是糖苷水解酶32家族(Glycosyl hydrolases family 32)的一員。菊粉酶普遍存在于微生物和植物中，其中來源于植物的菊粉酶只催化菊粉，來源于微生物的大部分菊粉酶除能催化菊粉外還能催化含有β-2, 1-糖苷鍵的糖，如蔗糖和棉子糖等；只有少部分來源于微生物的菊粉酶僅對菊粉有催化作用。微生物菊粉酶在菊粉的應用中發揮著關鍵的作用，本文主要從微生物菊粉酶方面進行論述。

表1 常見植物的菊粉含量

圖1 菊粉的化學結構Fig.1 Chemical structure of inulin

1 菊粉酶的分類

根據來源不同，菊粉酶可分為微生物菊粉酶和植物菊粉酶，根據菊粉酶在果聚糖鏈上催化方法的差別，菊粉酶可被分為外切型菊粉酶(EC3.2.1.80)和內切型菊粉酶(EC3.2.1.7)[5]。外切型菊粉酶可逐一切斷果聚糖鏈非還原性末端的β-2, 1-糖苷鍵，主要產物為果糖；果聚糖、菊粉、蔗糖等也可作其催化底物。菊粉果聚糖鏈內部的β-2, 1-糖苷鍵能隨機地被內切型菊粉酶斷開，低聚果糖(多為四糖或五糖)為主要產物，此外，內切型菊粉酶還缺乏蔗糖酶活性[6]。通常認為，I/S值是辨別轉化酶和菊粉酶以及外切酶和內切酶的主要參數，I表示菊粉做催化底物時的酶活，S表示蔗糖做催化底物時的酶活[1]。按照菊粉酶在微生物體內存在位置的差別可將其分為三種：位于細胞外的胞外酶，位于細胞壁的胞壁連系酶和位于細胞內的胞內酶。這三種酶的比例主要受菌種、溫度、pH、碳源的影響[7]。

2 菊粉酶的來源與性質

植物、泥土、水、動物消化道中的多種微生物都可以產生菊粉酶。據不完全統計，細菌的12個屬、酵母菌的10個屬和絲狀真菌的17個屬均可產生菊粉酶[8]。例如，絲狀真菌中的青霉屬(Penicillium)[9]、曲霉屬(Aspergillus)[10]，酵母菌中的克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)[11]、畢赤酵母屬(Pichia)[12]，細菌中的芽胞桿菌屬(Bacillus)[13]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[14]，其中又以曲霉屬、青霉屬及克魯維酵母屬的菊粉酶研究較多。大多數微生物菊粉酶均為外切型菊粉酶。外切型菊粉酶的主要酶學特性及菌株見表2。

表2 外切菊粉酶酶學性質

續表2-1

續表2-2

2.1 pH

絕大多數微生物產生的外切菊粉酶最適pH值為4.0～6.0，多數外切菊粉酶在最適pH附近可保持相對穩定。少數外切菊粉酶的最適pH值為中性(7.0)，如Bacilluspolymyxa[13]和Bacillussp.[34]來源的外切菊粉酶的最適pH值均為7.0；Sphingobacterium[40]來源的外切菊粉酶rInuAGN25的最適pH值為7.0，在pH值6.0～8.0的緩沖液中較穩定，孵育1 h后，酶能保持50%以上的相對活性；Arthrobacter[39]來源的外切菊粉酶rInuAMN8的最適pH值為7.0，在pH值6.0～9.0的緩沖液中較穩定，孵育1 h后，酶能保持60%以上的相對活性。極少數的外切菊粉酶的最適pH值偏堿性，如Actinomycete[43]來源的外切菊粉酶的最適pH值為8.0，在pH值5.0～11.0的緩沖液中較穩定，孵育1 h后，酶能保持81%以上的相對活性。Marinimicrobium[44]來源的外切菊粉酶的最適pH值為9.0。

綜上所述，大部分外切菊粉酶的最適pH為弱酸性，其活性在酸性至微堿性條件下保持穩定，而適應堿性條件的外切菊粉酶的相關特性還需要進一步研究。大部分外切菊粉酶適應酸性環境的機理還需要通過酶的突變、晶體結構解析等手段進一步揭示。

2.2 溫度

曲霉屬[16,19-20,22-23]來源的外切菊粉酶的最適溫度一般在60 ℃，低于70 ℃時，酶較穩定，半衰期較長；青霉屬[25-26,45]來源的外切菊粉酶最適溫度一般為5～55 ℃，低于70 ℃時，酶較穩定，半衰期較長；其他大部分外切菊粉酶的最適溫度均在50～60 ℃之間，而最適溫度為低溫或在低溫下活性較高的外切菊粉酶報導較少，本實驗室(生物能源持續開發利用教育部工程研究中心)發現的外切菊粉酶InuAGN25和InuAMN8就屬于低溫類型[39-40]。由于低溫酶能在低溫條件下進行摧氏反應，使其在應用上具有一定的優勢：超過地球總面積的75%為低溫環境，適合低溫酶催化作用；在低溫條件下處理的食品可防止食品營養損失和品質下降；將中溫或者高溫處理方式轉為低溫處理(終年低溫和季節性低溫地域的天然環境下的處理)方式可降低能耗[46]。例如，外切菊粉酶將菊粉水解為果糖，做為釀酒酵母的發酵底物，有些釀酒酵母可以在20 ℃以下發酵果糖生產酒和生物乙醇(一般酵母的發酵溫度多在30 ℃左右)，適合利用低溫酶，同時降低了因原料高溫加熱及冷卻造成的能耗損失。

低溫酶也普遍存在一些問題，酶的生產、保存等需要酶具有較好的熱穩定性，而低溫酶熱穩定性差，需要在保證活性的同時提高熱穩定性；隨著溫度降低，酶的催化活性也隨之降低，在低溫條件下，低溫酶較中高溫酶的活性相對較高，但為了滿足應用需求，仍然需要提高其低溫活性。因此，本實驗室通過理性設計方法增加低溫外切菊粉酶InuAGN25的離子鍵，設計了8點突變的突變體酶Mut8S，Mut8S的最適pH值為6.5，比InuAGN25的pH值提高0.5，最適溫度為40 ℃，相較于InuAGN25降低5 ℃，50 ℃處理60 min仍有100%的酶活，表明其熱穩定性高于InuAGN25[47]；本實驗室還通過刪除位于InuAGN25N端的3個氨基酸(Q23、T24和G25)，得到了突變體酶MutQ23△3。突變體酶MutQ23△3的最適溫度為45 ℃，與InuAGN25相同，但MutQ23△3經50 ℃處理60 min后，仍有100%的酶活，表明突變體酶MutQ23△3的熱穩定性也高于InuAGN25[48]。Zhou等[3]通過融合IBM(inulin-binding module)，得到外切菊粉酶突變酶rINUIBM，該突變酶的催化效率(kcat/Km(app))顯著高于野生酶rINU，最適溫度(60 ℃)比rINU高5 ℃，pH穩定性及熱穩定性有所提高，其最適pH值(4.5)與rINU相同。Arjomand等[15]采用定點突變方法刪除6個相鄰的loop區片段，得到外切菊粉酶突變株△6SL，該突變株的熱穩定性變差，表明該loop區片段對外切菊粉酶的熱性質有一定的影響。Arjomand等[18]采用定點突變的方法突變催化域的1個組氨酸殘基，得到H192A突變株，該突變酶的熱穩定性及催化活性均降低，表明His192對外切菊粉酶的熱性質有一定的影響。

2.3 比活力和動力學

不同來源的外切菊粉酶比活力和對菊粉的米氏常數差異均較大，即使是同一種屬的外切菊粉酶對菊粉的米氏常數也如此(表2)，如曲霉屬中的Aspergillusawamori和AspergillustubingensisCR16來源的外切菊粉酶的米氏常數分別為0.003和1.25 mmol/L[16,19,22-23]。

2.4 抑制劑和激活劑

金屬離子、有機試劑和表面活性劑對不同的外切菊粉酶均有不同的影響(表2)。Hg2+幾乎對所有的外切菊粉酶均具有抑制作用；Ag+抑制了大部分外切菊粉酶的活性，卻提高了Penicillium來源的2個外切菊粉酶活性[27]；EDTA對曲霉屬[22]、青霉屬[45]、鏈霉菌屬[35]、節桿菌屬[38]和克魯維酵母菌屬[31]來源的外切菊粉酶均具有抑制作用。

2.5 菊粉酶的結構及催化機制

菊粉酶是糖苷水解酶32家族(GH32)的一員，此家族有共同的三級結構特征，含2個結構域，N端結構域為催化域，是由β-折疊形成的5葉片螺旋槳結構；C端為β-折疊形成的似三明治狀結構(圖2)[49]。推測C端結構對外切菊粉酶的多聚體形成、酶與底物結合等起作用。本實驗室曾嘗試將C端去除，發現得到的突變體不能正常表達，也檢測不到外切菊粉酶酶活(結果未發表)，表明C端對外切菊粉酶的結構和功能產生了重要的影響，其作用機理還需要進一步研究。

菊粉酶的催化機制為雙替位機制。2個酸性氨基酸殘基(Glu和Asp)在該機制中起主要的催化作用[49]，在這個催化過程中，去質子化的氨基酸Asp41首先作為親和試劑攻擊底物糖基的異頭碳，從而與糖基形成共價中間體，此時，氨基酸Glu241提供質子進行酸催化，從而促進底物離去基團發生解離，致使糖苷鍵斷裂，接著Glu241發揮堿催化作用，激活水分子為受體分子，促使共價中間體的糖基與酶解離完成水解過程。

3 菊粉酶基因的異源表達

3.1 菊粉酶基因在大腸埃希菌表達系統中的表達

大腸埃希菌表達系統是最先用于表達外源基因的表達系統之一，該表達系統的機制也研究得較為成熟。大腸埃希菌遺傳背景清晰，傳代時間短，生長繁殖快，轉化和轉導效率高，營養要求簡單，并能高效表達外源基因[50]。隨著大腸埃希菌表達系統相關技術的成熟，在載體和菌株方面可有很多選擇[51]。此外，大腸埃希菌外源基因產物的表達水平較高、操作方便，較其他基因表達系統有一定的優勢[52]。因此，大腸埃希菌是目前基因工程中應用較廣泛的蛋白質表達系統[53]。

圖2 菊粉酶的三級結構Fig.2 Three-dimensional structure of inulinase

來源于原核生物和真核生物的外切菊粉酶基因在大腸埃希菌中均得到成功表達。Kwon等[13]將來源于BacilluspolymyxaMGL21的外切菊粉酶基因inu在E.coli中表達，其理論蛋白分子量為55.5 kDa，Km和最大反應速率Vmax分別為0.7 mmol/L和2 500 μmol/(min·mg)。同年，Tsujimoto等[41]將來源于GeobacillusstearothermophilusKP12899(生長溫度為41～69 ℃)的外切菊粉酶基因inuA在E.coliHB101中表達，其重組酶分子量為54 kDa，且該重組酶酶學性質與天然酶一致，首次獲得了重組酶的晶體。次年，Kim等[34]將來源于Bacillussp. snu-7的外切菊粉酶基因連接pRESET B 載體并在E.coliBL21(DE3)PLysS中過表達，其重組酶蛋白分子量為60 kDa，Km和Kcat分別為2.3 mmol/L和358.0/min。來源于真核生物的外切菊粉酶基因也能在大腸埃希菌表達系統中表達，Chen等[17]將來源于AspergillusficuumJNSP5-06的外切菊粉酶基因的兩個外顯子單獨擴增，通過overlap PCR結合在一起，并在E.coli表達，重組酶分子量為63 kDa，并在大腸埃希菌細胞上清液中測得最高酶活力達59.24 U/mg。Yedahall等[21]將來源于Aspergillusniger12的外切菊粉酶基因第一次在大腸埃希菌中進行異源表達，重組外切菊粉酶的蛋白分子量約為81 kDa，以菊粉作為底物，其動力學參數Km和最大反應速率Vmax分別是5.3 mmol/L和402 μmol/(min·mg)。Arjomand等[18]將黑曲霉外切菊粉酶基因及其突變體在大腸埃希菌中克隆表達，H192A突變體最大反應速率降低1.13倍，從野生酶的4 384.3 mol/(min·mg)降到了3 873.6 mol/(min·mg)，Km值增加1.7倍，從1.9 mmol/L增加到3.2 mmol/L，除此之外，酶的催化效率降低了約2倍。

本實驗室將黑頸鶴糞便分離菌Sphingobacteriumsp. GN25的外切菊粉酶基因在E.coliBL21 (DE3)中表達，酶活達290.9 U/mg[40]；將來源于Sphingomonassp. JB13的外切菊粉酶基因在E.coliBL21 (DE3)中表達，其重組酶分子量為54 kDa，酶活達73.7 U/mg[37]，該研究首次報道了一種耐洗滌劑、耐鹽、耐蛋白酶的外切菊粉酶；將來源于Arthrobactersp. HJ7外切菊粉酶基因在E.coliBL21 (DE3)中表達，重組酶rInuAHJ7的分子量為95.1 kDa，酶活達44.4 U/mL[38]，該研究首次報道了節桿菌來源的外切菊粉酶，該酶具有高分子量(95.1 kDa)并且在3.0%～20.0%NaCl濃度下還具有超過98%的酶活；將來源于Ar-throbactersp. MN8外切菊粉酶基因在E.coliBL21 (DE3)表達，重組酶rInuAMN8分子量為59 kDa，酶活達62.1 U/mL[39]。

3.2 菊粉酶基因在酵母表達系統中表達

單細胞真核生物酵母與原核生物大腸埃希菌相比，除了具有原核生物特點(易培養、繁殖快、遺傳操作簡單等)外，還具有真核生物在表達時對蛋白質進行正確的加工、修飾及合理的空間折疊等功能的特點，彌補了大腸埃希菌系統缺乏的蛋白質翻譯后加工、修飾的不足[54]。

Zhang等[55]將來源于菊芋的基因Ht1-FEHI和Ht1-FEHII分別在PichiapastorisX-33中表達，并對其酶學性質進行了測定，外切菊粉酶Ht1-FEH I的Km和Vmax分別為0.68和0.001 29 mg/min；Ht1-FEH II的Km和Vmax分別為0.92和0.004 8 mg/min。將Ht1-FEHI和Ht1-FEHII分別在釀酒酵母6525中進行異源表達，酶活分別為2.44和2.98 U/mL。Wang等[25]通過RACE PCR方法從Penicilliumjanthinellumstrain B01中得到外切菊粉酶基因inuA1的全長cDNA，并將inuA1亞克隆到pPICZaC 表達載體，在P.pastorisX-33中成功過表達，純化的重組酶分子量為100 kDa，在發酵液中的最高酶活達272.8 U/mL。Cao等[32]將來源于CryptococcusaureusHYA的外切菊粉酶基因亞克隆到pPICZaA表達載體并在P.pastorisX-33中表達，重組酶分子量為60 kDa，重組酶酶活為16.3 U/mL。Ma等[28]將來源于Kluyveromycescicerisporus的外切菊粉酶基因kcINU1在P.pastorisX-33中表達，重組酶分子量為90 kDa，重組酶酶活為45.2 U/mL。

王婧等[56]將來源于克魯維酵母菌的基因inuB1連接pPIC9K表達載體，轉化到P.pastorisGS115，獲得GS115/inuB1菊粉酶基因工程菌。GS115/inuB1經甲醇誘導發酵表達菊粉酶，表觀分子量為90 kDa，比酶活性為12.29 U/mg。Zhang等[29]將來源于克魯維酵母KW02的外切菊粉酶基因在P.pastorisGS115中表達，重組酶酶活為52.0 U/mL，是野生酶的12倍，重組酶分子量為85 kDa，理論分子量為62 kDa。祝林等[57]將來源于克魯維酵母菌ATCC12424的外切菊粉酶基因構建了外切菊粉酶畢赤酵母重組菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201)，并進行發酵培養，表觀分子量為90 kDa，將外切菊粉酶用去糖基化酶處理后，分子量為60 kDa，菌株GS115(pHBM1200)表達的外切菊粉酶酶活最高為89.43 U/mL，菌株GS115(pHBM1201)表達的外切菊粉酶酶活最高為14.828 U/mL。熊伍平等[31]將來源于KluyveromycesmarxianusDSM 5418的外切菊粉酶基因kcINU1在P.pastorisGS115中表達，重組酶分子量為90 kDa，理論分子量60 kDa，重組酶酶活為15.27 U/mL。

Zhang等[29]在Saccharomycessp. W0尿嘧啶突變株中異源表達來自季也蒙畢赤酵母中的基因INU1，在培養發酵72 h后，重組菌所產的外切菊粉酶活力達到34.2 U/mL。Wang等[59]將來源于P.guilliermondiistrain 1外切菊糖酶基因INU1轉到Saccharomycessp.W0尿嘧啶突變體，獲得菌株MguINU1-04，該菌株在72 h內可產生34.8 U/ml的外切菊粉酶活性，經過5次連續分批培養，該菌株能穩定地產生較高的菊粉酶活性。Zhang等[60]將來源于海洋酵母屬的flavinogenieW14-3外切菊粉酶基因連接pMIRSC11載體并在Saccharomycessp.W0中重組表達，重組酵母菌W14-3-INU-112酶活為16.8 U/mL。Wang等[61]構建了S.cerevisiae重組菌株JZH-InuMKC，共表達基因InuC和InuMK1，該重組菌培養72 h，胞外菊粉酶活達到14.8 U/mL。

綜上所述，酵母表達系統中酵母表達的外切菊粉酶基因來源于植物、酵母、霉菌，多為真核生物基因；表達宿主多為P.pastorisX-33、P.pastorisGS115和Saccharomycessp.W0尿嘧啶突變體。

4 外切菊粉酶的應用

雖然菊粉在飲料、乳制品、保健品等方面應用較為廣泛，但菊粉甜度低、水溶性較差[1]等問題仍然對產品品質造成影響，利用外切菊粉酶能水解菊粉生成90%～95%[36]的果糖這一特性，將果糖廣泛應用于醫藥工業、食品工業和能源工業(圖3)，對菊粉進行更深層次、高附加值的生物產品開發將成為充分利用豐富的菊粉資源的新方向。

4.1 外切菊粉酶在高果糖漿生產中的應用

高果糖漿(High-fructose syrup)被廣泛用于食品和醫藥工業。1970年以來，各國最初是以淀粉和菊粉為原料，利用酶水解法和酸法制備果糖。酸法生產果糖產量雖高，但色素重、附屬產物多，不容易分離煉制。以淀粉為原料，利用酶法生產果糖，至少通過α-淀粉酶的液化、糖化酶的糖化和葡萄糖異構酶的異構化三步反應才能從玉米淀粉中得到42%的高果糖漿[62]，利用外切菊粉酶水解菊粉生產果糖糖漿，只需1步酶解，果糖含量高達90%～95%，因此該方法具有轉化過程簡單，產物單一且純度高、低污染的優點，是目前生產超高濃度果糖糖漿的優良方法[62]。王建華等[63]在酶法制備高果糖的優化時發現，15.0%的菊糖添加22 U/g的酶量，50 ℃反應6～36 h，底物水解率約95%，其中果糖含量占水解生成物的95%以上，葡萄糖含量小于5%，不含其他糖。Singh等[64]用離子交換樹脂將來源于KluyveromycesmarxianusYS-1的外切菊粉酶進行固定化處理，并用25 IU的固定化外切菊粉酶55 ℃條件下分別發酵Asparagusracemosus來源的菊粉和純菊粉，4 h內分別產生了39.2和40.2 g/L的果糖，即分別產生了85.5%和92.6%的總還原糖。Singh等[27]利用來源于P.oxalicumBGPUP-4的外切菊粉酶，在4 h、125 r/min條件下，菊粉水解率可達91.1%，總還原糖釋放量達45.55 g/L，其中含有42.99 g/L的果糖和2.56 g/L的葡萄糖。

圖3 外切菊粉酶及其應用Fig.3 Exo-inulinases and their industrial applications

4.2 外切菊粉酶在酒精生產中的應用

利用外切菊粉酶發酵生產酒精，為酒精的生產提供了一條新途徑。產菊粉酶微生物與釀酒酵母同步糖化菊粉或菊芋粗提液發酵生產酒精，菊芋粗提液幾乎能被完全利用，且不需要再添加其他營養成分，酒精得率達96%[65]。同步糖化法比先酸解或酶解菊粉，再發酵果糖生產乙醇的兩步法具有更多優勢，省去了菊粉酸解或酶解的步驟，流程簡化，成本降低，同步糖化發酵法還可以減少或去除菊粉水解產物的積累，進而降低產物對菊粉酶的抑制作用，有利于保持較高的生產強度，從而具備優良的工業化生產特點[66]。Zhang等[58]在Saccharomycessp. W0尿嘧啶突變株中異源表達來自季也蒙畢赤酵母的基因INU1，在培養72 h后，可直接將菊粉水解發酵生產酒精，發酵液與酒精的體積分數為100∶13.7，果糖的轉化率高達99.1%。呂躍鋼等[67]將釀酒酵母與菊粉酶共同固定化，以菊芋為原料，在催化溫度30 ℃、pH值5.5、糖濃度20%、轉速為13.5 mE/min條件下，酒精發酵速率最快，發酵24 h，酒精轉化率高達98.5%，酒精含量在發酵醪中達11.98%(體積分數)。Wang等[59]將外切菊糖酶基因INU1轉到Saccharomycessp. W0尿嘧啶突變體中，獲得菌株MguINU1-04并能利用30.0%菊粉進行發酵，獲得14.7%(體積分數)的乙醇，乙醇產率高于0.386 g/g菊粉。Wang等[61]構建的二倍體菌株JZD-InuMKCP，其乙醇產量達到了理論最大值，用該菌株發酵200 g/L菊粉時，乙醇產量達到2.44 g/(L·h)，發酵250 g/L的耶路撒冷朝鮮薊塊莖粉時，乙醇產量達3.13 g/(L·h)。Zhang等[60]將重組酵母菌W14-3-INU-112以250 g/L的菊粉作為底物，發酵168 h，能產生12.5%(體積分數)的乙醇。Yuan等[24]將來源于Candidakutaonensis的外切菊粉酶基因在S.cerevisiaeJZ1C、JZ1C-inuKM和JZ1C-inuCK中進行表達，并在48 h內發酵200 g/L的菊粉，分別產生0.34、0.34和0.38 g/g的乙醇。

4.3 外切菊粉酶的其他應用

外切菊粉酶還可應用到生物柴油、醫藥等行業。Shi等[6]將外切菊粉酶和內切菊粉酶基因在Yarrowialipolytica中共表達，得到轉化株X+N8，該轉化株發酵72 h，菊粉酶酶活達到124.33 U/mL，發酵菊粉78 h，可得到41.87%(質量分數)的單細胞油，細胞干重達13.63 g/L，產物中超過95.01%的脂肪酸為C16～C18，可以做為生物柴油的原料。Jiang等[68]通過Clostridiumtyrobutyricum異源表達外切菊粉酶基因，利用菊芋產氫。Petrova等[2]利用LactobacillusparacaseiDSM 23505產生外切菊粉酶，將136 g/L的菊苣粉(89.3%菊粉和10.7%的蔗糖、果糖和葡萄糖混合物)完全轉化為123.7 g/L的乳酸。

5 展 望

為了更好地滿足應用需求，需要從新的環境中進一步發掘新的外切菊粉酶及菌種，或將現有外切菊粉酶進行理性設計或定向進化改良，得到高酶活、耐產物抑制、具低溫活性、熱穩定性好、在低pH條件下具有最優的活性和穩定性、耐受乙醇及耐受蛋白酶的外切菊粉酶，同時得到能高效表達外切菊粉酶的菌種。需要對具有某種酶學特性(例如低溫活性)的外切菊粉酶進行晶體結構解析，找到影響該酶學特性的氨基酸和結構，通過突變進一步明確這些氨基酸和結構的功能，進而揭示這些酶學特性的機理，這將有利于指導外切菊粉酶的改良，為外切菊粉酶應用于生產提供參考。