研究膽堿能受體激動劑對天皰瘡棘層松解的逆轉作用及其機制

艾潔

（內蒙古包頭市腫瘤醫院，內蒙古 包頭）

0 引言

天皰瘡是一類原因尚未明確的自身免疫性大皰性疾病類型，臨床上一般選用足量糖皮質激素予以治療，若病情過于嚴重者可行血漿交換療法，一般尋常性天皰瘡可經久不愈。天皰瘡多發于老年群體，病程較為緩慢，病情進展緩慢時，雖不致命，但病情嚴重且經常復發的情況下，便可危及生命，因此需選用具有及時性和針對性的臨床治療手段實行相應治療，緩解并控制病情，積極促進病情轉優。選用糖皮質激素進行治療可有效緩解天皰瘡患者的皮膚癥狀，降低天皰瘡導致的病死率，同時積極促進病情轉優，但選用糖皮質激素予以治療會發生不確定性的不良反應，若不良反應太過嚴重，會直接危及天皰瘡患者的生命安全，不僅不能降低天皰瘡的病死率，反而會因不良反應使病死率持續增長[1-3]。有相關研究表明，乙酰膽堿液可在改善天皰瘡患者的臨床癥狀中發揮一定效用，膽堿能激動劑對棘層松解有一定程度的抑制作用，但目前還未明確具體作用機制，因而本次研究決定對天皰瘡棘層松解的相關情況進行針對性的探究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

抽取某院皮膚科2017 年2 月至2020 年2 月收治的46 例天皰瘡患者參與研究調查，年齡在20～75 歲，平均（50.23±6.19）歲。

1.2 方法及標準

參照《2014 EDF/EADV 天皰瘡診斷和治療指南（s2）-皮膚性指南》制定標準：正常HaCaT 細胞（中國醫學科皮膚病研究所提供）和10% 胎牛血清-DMEM 培養液（美國Life Technnologies 公司提供）。將尋常型天皰瘡患者和正常體檢者血清純化后可得尋常型和正常型的IgG（免疫球蛋白G），濃縮后可得20 g/L 的IgG，橋粒芯蛋白抗體--653 U/mL，Dsg1 抗體--343 U/mL，免疫球蛋白G 的終濃度--1g/L[4-5]。

實驗所用試劑--卡巴膽堿（美國Sigma-Aldrich 公司）；分散酶Ⅱ；上樣緩沖液、鼠抗人Dsg3 抗體、MOPS 電泳緩沖液、Trizol、Bis-tris 預制膠（美國Life Technnologies 公司）；磷酸化p38 MAPK、磷酸化EGFR 抗體、表皮生長因子受體（美國Cell Signal Technology 公司）、免疫印跡洗脫液、免疫共沉淀試劑盒（美國Thermo Fisher scientific 公司）；鼠抗人橋斑珠蛋白抗體（美國BD 公司）；HRP 標記山羊抗兔IgG 抗體、Triton X-100 裂解液、RIPA 裂解液、HRP 標記山羊抗小鼠IgG 抗體；qPCR 試劑盒；橋粒芯蛋白抗體檢測試劑盒；逆轉錄試劑盒等各項所用試劑。

分組--將HaCaT 細胞培養后進行合適分組（至80%時劃分）：正常組；PV-IgG 組；NH-IgG+ 卡板膽堿和PV-IgG+卡巴膽堿組[6-7]。

HaCaT 細胞解離實驗-- 用磷酸鹽緩沖液沖洗HaCaT細胞，加入分散酶Ⅱ后放于37° 的孵箱中，30 min 后，將培養皿與細胞單層相分離，最后在機械力的作用下使細胞出現解離。

免疫熒光-- 細胞經處理清洗后，加入4% 的多聚甲醛固定10 min；清洗后，加入0.1% Triton X-1005 min 后再清洗。加入抗體孵育1 h，二抗45 min；加入7.5 mg/L Hoeches 33342 染色，標記細胞核。

蛋白抽提--HaCaT 細胞清洗后，加入Triton X-100 裂解液或RIPA，裂解細胞，當HaCaT 細胞全面裂解后，將細胞裂解出的膜蛋白和胞質蛋白抽提出來；將抽提后的溫度維持在4 ℃左右，待5 min 后，在培養皿的一端迅速將細胞裂解液快速刮于其上（選用細胞刮），吸至離心管中，離心15 min 后收集上清液。

免疫印跡-- 蛋白定量后，混合提取后的蛋白與上樣緩沖液，加熱變性后上樣。一系列正常操作后，三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液洗去未結合二抗后，選用化學發光法在凝膠成像儀上觀察各自條帶。

不同細胞表面蛋白mRNA 表達--細胞用PBS 清洗兩次后，提取RNA，濃度測定選用蛋白核酸分析儀，后續依照逆轉錄試劑盒說明操作。

免疫共沉淀--按照免疫共沉淀試劑盒說明書流程操作。

1.3 統計學方法

利用S P S S 1 8.0 軟件分析、處理，用t檢驗計量資料（±s），P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

①卡巴膽堿逆轉天皰瘡棘層松解--尋常型天皰瘡組細胞碎片數目：（46.58±2.01）；正常組：（5.02±0.57）。免疫熒光實驗中，尋常型天皰瘡組Dsg3 和PG 均出現細胞內聚集現象；②卡巴膽堿影響Dsg3 和PG 之間的相互作用--免疫共沉淀實驗，HaCaT 細胞在PV-IgG 作用下，Dsg3 減少；加入卡巴膽堿后，Dsg3 恢復正常水平；③卡巴膽堿影響棘層松解相關信號分子磷酸化水平--HaCaT 細胞p38MAPK 在PV-IgG作用下與EGFR 發生磷酸化；加入卡巴膽堿后，p38MAPK 水平未變化，抑制EGFR 的磷酸化；④卡巴膽堿影響橋粒分子mRNA 水平的表達。

3 討論

天皰瘡屬于自身免疫性皮膚病，以正常皮膚或黏膜上出現松弛性水皰為主要表現，尼氏征陽性，若不針對此類臨床癥狀采取及時有效的措施，不但會造成皮膚損傷，還可能引起精神障礙、發熱等全身性癥狀，嚴重影響天皰瘡患者的日常生活水平和質量。在構建的天皰瘡細胞模型中加入卡巴膽堿，橋粒蛋白染色模式和細胞解離發生逆轉，證實卡巴膽堿對棘層松解有逆轉作用，同時卡巴膽堿還可增加Dsg3 的熒光強度[8-10]。構建模型中的Dsg3 和PG 這兩項指標的總蛋白量一直在下降，由此可知，蛋白總量和表達水平下降不存在聯系，反而可能是蛋白內化降解導致。由本次研究實驗可得，在構建模型中加入卡巴膽堿，模型中的各種變化都在逆轉，可穩定橋粒結構；卡巴膽堿可抑制EGFR 磷酸化，但不會對p38MAPK 磷酸化產生影響，這說明較下游信號途徑是卡巴膽堿的作用之處，進而抑制棘層松解。本次研究對天皰瘡棘層松解的相關情況進行相關性的探究，依據研究結果可知，尋常型天皰瘡組在細胞解離實驗中顯示細胞碎片數目為（46.58±2.01）；棘層松解相關信號分子磷酸化水平，Dsg3 和PG 間的相互作用和橋粒分子mRNA 水平的表達三項水平或相關作用效果均受卡巴膽堿的影響。

綜上所述，天皰瘡棘層松解選用膽堿能受體可呈現一定的逆轉作用，相應逆轉機制包括--加強PG 和Dsg3 的相互作用；抑制前兩項指標的內化加強表達；抑制棘層松解EGFR的磷酸化。