基于光譜學分析探討磷的釋放促進釀酒酵母菌生物礦化鈾的研究

張 偉，董發勤，賀小春，宋懷慶，覃貽琳，熊 鑫，唐子涵

1. 西南科技大學分析測試中心，四川 綿陽 621010 2. 中國工程物理研究院激光聚變研究中心，四川 綿陽 621900 3. 西南科技大學固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室，四川 綿陽 621010 4. 西南科技大學環境與資源學院，四川 綿陽 621010 5. 西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010

引 言

隨著核技術和核電工業的快速發展，越來越多的含鈾廢水進入到生態環境中。國家規定，對于無受納水體時含鈾廢水的排放標準是鈾的濃度應<0.05 mg·L-1。而目前含鈾廢水中鈾的濃度均高于這個數值。水體中對環境危害較大的鈾主要以U(Ⅵ)存在，具備可溶性和易遷移性。U(Ⅵ)可通過水體流動和食物鏈的遷移進入到生態圈，進而嚴重威脅人類健康和自然生態環境。因此，妥善處理含U(Ⅵ)廢水勢在必行。目前，常用的含鈾廢水處理技術包括化學沉淀法、離子交換法、溶劑萃取法、蒸發濃縮法和膜分離法等，但上述方法在運行過程中存在成本高、效率低、二次污染物明顯等問題，且難以有效處理大量低濃度的含鈾廢水[1-2]。

近年來蓬勃發展的微生物修復技術因其具有成本低、效率高、環境友好、且能同時處理多種污染物等特點，而在核廢處理領域受到廣泛的關注與研究。目前，大量關于微生物與U(Ⅵ)相互作用的文獻報道集中在微生物對鈾的吸附行為和結合鈾的機制探討兩方面。微生物可以通過不同的機制與U(Ⅵ)作用，如生物表面吸附、生物體內富集、生物還原和生物礦化。其中，生物礦化機制尤為重要。鈾的生物礦化研究可以追溯到1992年Macaskie等發現檸檬酸桿菌在生理條件下將鈾以多晶HUO2PO4形式沉淀[3]。此后，許多微生物開始被用于研究U(Ⅵ)的礦化。如蘇云金桿菌可將U(Ⅵ)以(NH4)(UO2)PO4·3H2O納米晶體的形式固定在胞內[4]。海洋細菌IdiomarinaloihiensisMAH1可通過有機磷酸基與鈾作用形成Ca(UO2)2(PO4)2·6H2O沉淀[5]。芽孢桿菌B.subtilis礦化鈾的過程中其細胞壁上羧基和磷酸基是鈾的主要配體[6]。Kocuriasp.可與鈾形成CaU(PO4)2，并且礦化進行的程度可能取決于細胞中磷酸鹽的釋放[7]。綜上可以看出，研究人員已經關注并通過FTIR、EDS等測試手段間接推測出磷酸基團或磷酸鹽可能在生物體礦化鈾的過程中發揮重要作用。但磷作為生物體必需的化學元素之一，微生物在與鈾作用過程中自身釋放磷的能力及磷的消耗與U(Ⅵ)量變化的相互關系卻缺乏直接、系統的研究數據； 磷在生物礦化體中的表征和磷參與的鈾生物礦化機制也鮮有探討。

因此，本文選取發酵工業的副產物、模式微生物——釀酒酵母菌為研究對象，基于近年來國內外的研究成果和自身的研究工作，探究磷參與的釀酒酵母菌生物礦化鈾的行為及機制。通過靜態批次吸附實驗，考察鈾酰離子、pH值和磷的釋放在生物吸附過程中的相互作用和影響。結合介觀分析和光譜學表征手段，深入探討了微生物與鈾作用過程中釀酒酵母菌釋放磷的行為與鈾生物礦化的關系。這一研究可為后續開展鈾污染的微生物原位修復應用提供基礎實驗數據及參考，并有助于深入理解放射性核素鈾在自然界中的活化和固定化過程。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

微生物預處理： 實驗所用微生物為市售的釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)。稱取一定量的干酵母粉加入到錐形瓶中蓋上塞子，共同放入手提式壓力蒸汽消毒器(0.15 MPa、125 ℃)中滅活20 min，滅活完成后將其放在干燥箱中40 ℃干燥24 h，取出后放入干燥皿中備用。

U(Ⅵ)儲備液配置： 準確稱取2.109 2 g硝酸氧鈾酰[UO2(NO3)2·6H2O]溶解于0.1 mol·L-1的硝酸溶液中，再轉移至1 000 mL棕色容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻，即得1 000 mg·L-1的U(Ⅵ)儲備液。實驗時根據需要將U(Ⅵ)儲備液稀釋至不同濃度，其pH值用0.10 mol·L-1的NaOH和HCl調節。實驗用化學試劑均為分析純。

主要儀器： 電感耦合等離子體發射光譜質譜儀(Agilent7700x型，美國安捷倫公司)、電感耦合等離子體發射光譜儀(iCAP6500，美國ThermoFisher公司)、紅外光譜儀(Spectrum One型，美國鉑金埃爾默公司)、X射線光電子能譜儀(K-Al-PHA+型，美國ThermoFisher公司)、高分辨冷場發射掃描電子顯微鏡(U1tra 55型，德國卡爾蔡司公司)、X射線衍射儀(X′Pert PRO型，荷蘭帕納科公司)。

1.2 靜態批次吸附實驗

根據不同實驗目的，分別向100 mL的錐形瓶中加入20 mL實驗設定濃度的鈾溶液和實驗設定量的釀酒酵母菌，混合均勻后共同放置在恒溫水浴振蕩器中振蕩吸附一定時間后，取樣離心(10 000 r·min-1，15 min)，利用電感耦合等離子體發射光譜質譜儀測定離心后上清液中剩余的U(Ⅵ)離子濃度。離心得到的菌體沉淀經冷凍干燥后分別進行FTIR，XPS和XRD測試。用移液器汲取反應前后的菌懸液滴于蓋玻片上，自然風干后用2.5%的戊二醛溶液浸泡過夜，再用乙醇梯度脫水，自然干燥后待測SEM。釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的吸附量q(mg·g-1)和去除率R(%)的計算公式如式(1)和式(2)

(1)

(2)

式中，c0為溶液中U(Ⅵ)初始濃度(mg·L-1)，ct為反應進行到t時刻溶液中U(Ⅵ)的濃度(mg·L-1)，V為錐形瓶中的溶液體積(L)，m為吸附劑用量(g)。

2 結果與討論

2.1 吸附過程中溶液初始pH值與磷的溶出、U(Ⅵ)去除的關系

圖1(a)考察了溶液初始pH值在1.0～7.0范圍內釀酒酵母菌對鈾的去除情況。由圖可知，釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的去除效率與溶液初始pH值密切相關。當pH≤3.0時，釀酒酵母對U(Ⅵ)的去除率和吸附量隨pH值的升高而增大。當pH≥3.0時，去除率和吸附量則出現下降趨勢。pH 3.0時，釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的去除率和吸附量均達到最大值，分別為93.2%和15.7 mg·g-1。

此外，我們還對反應前后溶液pH值的變化及磷的釋放量進行了測試，結果見表1和圖2?？梢钥闯?，吸附實驗進行60 min后，溶液pH值較反應前均明顯升高，說明釀酒酵母菌在與U(Ⅵ)作用過程中可能釋放了羥基離子或者已有的氫離子參與了反應?？疾觳煌琾H值下吸附體系中磷的釋放量(圖2)可知： 與對照組相比，釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用后溶液中磷的含量明顯低于對照組； 且當U(Ⅵ)的去除量最大時(pH=3.0)，磷的消耗量也最大。

圖1 (a)溶液初始pH值對釀酒酵母菌去除U(Ⅵ)的影響; (b)不同pH下100 mg·L-1鈾的物種分布

表1 釀酒酵母菌吸附U(Ⅵ)反應前后溶液pH值的變化

綜合以上分析發現，釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用后，U(Ⅵ)的濃度降低，溶液pH值升高，磷的濃度降低，說明溶液中的H+和釀酒酵母菌在溶液中釋放的磷參與了釀酒酵母菌去除鈾的過程。因此，推測溶液中釀酒酵母菌去除U(Ⅵ)的化學作用方程可能為

(3)

圖2 不同pH值下釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用后 溶液中磷含量的變化

2.2 吸附動力學分析

圖3考察了釀酒酵母菌在0～180 min內對U(Ⅵ)的去除情況。結果表明，釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的去除過程包括快速去除(0～5 min)和慢速去除(5～180 min)兩個階段。當t=5 min時，釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的去除率和吸附量分別為85.3%和16.2 mg·g-1，吸附量已達整個平衡吸附總量的93%左右。結合前文分析推測快速去除過程應該是靜電引力起主導作用。5 min≤t≤60 min，釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的去除增長4%左右；t在60～180 min時，釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的去除僅增長1%左右。

圖3 (a)作用時間對釀酒酵母菌吸附U(Ⅵ)的影響和準二級動力學模型; (b)Webber內擴散模型

為了探討吸附過程中U(Ⅵ)在釀酒酵母菌上的吸附速率和機理，我們采用準二級動力學方程和Webber內擴散模型來擬合上述實驗數據。由圖3(a)可知，準二級動力學模型擬合方程為y=0.027 35+0.057 34x，R2=0.999 9。計算獲得的平衡吸附量qe，cal=17.44 mg·g-1與實驗得到的qe，exp=17.42 mg·g-1相接近，說明準二級動力學吸附模型適合描述釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的吸附過程，揭示化學吸附是此過程的控速步驟。以qt對t0.5作圖，得到Webber內擴散模型擬合圖。由圖3(b)可知- Webber內擴散模型擬合的相關系數較低，且擬合線不過原點，說明吸附受多個過程的影響。將實驗數據分段擬合后可看出此吸附過程分為兩部分，t≤60 min是膜擴散部分(D1段)，即U(Ⅵ)在菌體細胞表面的快速吸附階段；t>60 min后則是吸附劑內擴散部分(D2段)，即細胞內擴散速率控制的過程。

綜上可知，釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的吸附存在物理和化學吸附行為，且限速步驟可能是膜擴散和細胞內擴散共同作用的結果。

2.3 吸附熱力學分析

反應溫度對釀酒酵母菌吸附U(Ⅵ)的影響見圖4。選取288，298和308 K三個溫度點進行了實驗，結果表明反應溫度對釀酒酵母菌吸附U(Ⅵ)基本沒有影響。對不同反應溫度下的實驗數據進行吸附反應熱力學參數計算(表2)，可以看出： 在288，298和308 K時，吸附反應的吉布斯自由能ΔG0<0，說明釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的吸附可以自發進行，且溫度越高，自發進行的程度增大。反應的熵值ΔS0>0，說明溶液中U(Ⅵ)與釀酒酵母菌具有較高的親和力，系統混亂度增加。反應的焓值ΔH0>0，說明此吸附為吸熱反應且存在化學吸附[10]。

圖4 反應溫度對釀酒酵母菌吸附U(Ⅵ)的影響(c0=100 mg·L-1, pH=3.0, t=60 min, M=5 g·L-1

表2 釀酒酵母菌吸附U(Ⅵ)的熱力學參數Table 2 Thermodynamic parameters for the biosorptionof uranium by S. cerevisiae

2.4 與U(Ⅵ)作用前后菌體沉淀的FTIR分析

釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用前后的紅外光譜如圖5(a)所示，按文獻[11-12]對主要譜帶歸屬分析如下： 釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用前后吸收峰的變化主要集中在3 400 cm-1附近和900～1 800 cm-1范圍內。3 400 cm-1附近較寬的特征峰是O—H伸縮振動和N—H伸縮振動耦合峰。與U(Ⅵ)作用后，該處峰位從3 434 cm-1紅移到3 410 cm-1，且峰形更寬，說明釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用時，—OH中的O原子因參與了絡合鈾酰離子而導致其鍵長改變、吸收峰紅移； N—H鍵也因與U(Ⅵ)發生了反應而引起振動頻率和吸收強度的改變。

圖5 (a)釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用前后的FTIR圖; (b) 900～1 800 cm-1范圍的紅外分峰擬合圖

綜上所述推測，釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用過程中，菌體細胞壁保持完整且是主要的作用場所，細胞壁上的磷酸基團、氨基、羥基、羧基和羰基等是主要的活性吸附基團。

2.5 與U(Ⅵ)作用前后菌體的SEM-EDS分析

釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用的SEM-EDS分析見圖6?？梢钥闯?，釀酒酵母菌細胞呈橢圓形，寬度約2～4 μm，長度約3～6 μm。與U(Ⅵ)作用前，菌體細胞完整，表面飽滿且光滑。與U(Ⅵ)作用后，菌體細胞表面褶皺增多，部分納米級鱗片狀物質沉積在表面。對這些鱗片狀沉積物進行EDS分析發現： 與U(Ⅵ)作用后的樣品在結合能2.5～4.5 keV范圍內出現U的特征峰，其質量分數為2.44%，原子百分比為0.16%。且作用后的EDS圖顯示菌體表面沉積物中磷的峰強明顯增加，由此推測釀酒酵母菌細胞表面沉積的鱗片狀沉淀可能是鈾和磷形成的絡合物。

圖6 釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用前后的SEM-EDS圖 (a)： 吸附前； (b)： 吸附后Fig.6 SEM-EDS of S. cerevisiae before and after reaction with uranium (a)： Control; (b)： After reaction

2.6 與U(Ⅵ)作用前后菌體的XPS分析

為了深入分析磷在釀酒酵母菌吸附鈾中的作用，對反應前后的菌體沉淀進行了XPS光譜測試，結果見圖7。與對照組相比，作用后的全譜[圖7(a)]中出現了U4f和U4d特征峰，說明釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用過程中可以將鈾固定在菌體表面。利用XPSpeak軟件對U4f峰分峰擬合[圖7(b)]后發現： 在結合能為380.2，382.2 eV和391.3，393.1 eV分別出現了U4f7/2和U4f5/2特征峰。其中，382.2和393.1 eV對應U(Ⅵ)的特征峰，380.2和391.3 eV對應U(Ⅳ)的特征峰[14]。說明菌體在與U(Ⅵ)作用時胞內釋放的具有還原性的物質可將一部分U(Ⅵ)還原成U(Ⅳ)。

觀察P(2p)的特征峰[圖7(c)]發現： 釀酒酵母菌對照組在133.4 eV出現P(2p)的特征峰。與鈾作用后，P(2p)特征峰藍移到133.8 eV，且對應的峰面積增加。此外，通過計算XPS譜圖中P(2p)峰面積與C(1s)峰面積的比值，可以間接反映磷的相對含量。因此作者又考察了U(Ⅵ)不同吸附容量下菌體表面Sp/Sc比值，結果見圖7(d)。隨著U(Ⅵ)吸附量的增加，菌體表面Sp/Sc的比值逐漸增大。當吸附量為66.9 mg·g-1時，其Sp/Sc比值是對照組的2.2倍，說明菌體表面沉積的物質中含有磷元素，磷確實參與并促進了釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的吸附。磷的來源可能是釀酒酵母菌胞內磷酸酶釋放的無機磷酸鹽生成，然后成為與U(Ⅵ)結合的沉淀配體，進而增強了生物體對U(Ⅵ)的吸附[15]。

圖7 釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用前后的XPS譜圖 (a)： 全譜； (b)： U(4f)高分辨譜； (c)： P(2p)高分辨譜； (d)： P(2p)峰面積與C(1s)峰面積的比值Fig.7 X-ray photoelectron binding energy curves of S. cerevisiae before and after biosorption (a)： Full spectrum; (b)： U(4f) spectra; (c)： P(2p) spectra; (d)： The ratio of Sp/Sc under different uranium adsorption capacity

2.7 與U(Ⅵ)作用前后菌體的XRD分析

圖8為釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用前后的XRD圖譜?？梢钥闯?，與U(Ⅵ)作用前的圖譜沒有晶體特征峰出現。與U(Ⅵ)作用后，菌體沉淀出現明顯的晶體衍射峰。經與ICDD數據庫比對可知，出現的晶體衍射峰與編號PDF-86-0687和PDF-08-0296的特征峰基本相吻合，說明U(Ⅵ)與釀酒酵母菌作用后，可在其細胞外表面形成H2(UO2)2(PO4)2·8H2O和CaU(PO4)2晶體。這一結果與前文2.1節中釀酒酵母菌去除U(Ⅵ)的化學作用分析相吻合，同時也說明磷是引起釀酒酵母菌生物礦化鈾的主要功能元素。

圖8 釀酒酵母菌與U(Ⅵ)作用前后的XRD分析Fig.8 XRD patterns of S. cerevisiae before and after biosorption of uranium

3 結 論

(1)通過ICP-OES，FTIR和XPS等一系列光譜學手段分析發現，釀酒酵母菌可以有效去除水體的U(Ⅵ)，且生物體在與U(Ⅵ)作用過程中釋放的磷是引起其生物礦化鈾的主要功能元素。

(2)在溶液初始pH 3.0時，釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的去除效果最好。溶液中的H+和釀酒酵母菌釋放的磷參與了去除U(Ⅵ)的過程。釀酒酵母菌對U(Ⅵ)的吸附不受反應溫度的影響，是自發的、吸熱行為。

(3)釀酒酵母菌與U(Ⅵ)的作用是一個復雜的相互作用過程。推測釀酒酵母菌生物礦化鈾的機理為： 最初在靜電引力作用下，U(Ⅵ)被迅速吸附到菌體細胞表面，隨后以配位的形式被菌體表面的磷酸鹽、羥基和酰胺等官能團絡合； 溶液中的H+和釀酒酵母菌釋放的無機磷酸鹽可作為與U(Ⅵ)結合的沉淀配體，繼續礦化形成鱗片狀的晶體物質H2(UO2)2(PO4)2·8H2O后被固定在細胞外表面。此外，少部分的U(Ⅵ)被菌體胞內釋放的物質還原成U(Ⅳ)形成CaU(PO4)2沉降下來。因此，釀酒酵母菌細胞釋放的磷參與并促進了其生物礦化鈾。研究微生物與鈾相互作用的微觀機理對鈾污染的微生物原位修復和認識鈾的地球化學循環具有比較重要的意義。