基于聚腺嘌呤單鏈DNA-金納米簇的熒光法高靈敏快速檢測汞離子

歐麗娟，安學忠，羅建新，王凌云，薄 恒，孫愛明，陳蘭蘭

湖南工學院材料與化學工程學院, 湖南 衡陽 421002

引 言

汞是一種具有生物累積、食物鏈放大和高毒性的重金屬離子污染物，不易降解，且環境污染持久[1]。即便少量存在于環境中，也會給環境和人類健康帶來極大的威脅。研究表明，少量的汞暴露會導致神經系統、腎臟、造血系統、肝臟等各方面的疾病[2]。研究發展高靈敏、高選擇性的汞檢測手段在環境監測和生命科學領域具有極為重要的意義。

傳統的檢測汞離子的方法有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質譜法等。這些方法大都依賴大型精密貴重儀器，需專業人員操作，且操作步驟繁瑣費時。近年來，發展了一系列新的熒光技術用于汞離子的檢測，如半導體量子點、有機熒光分子等[3-4]。這些方法可以實現對汞離子高靈敏度、高效率的檢測。但是，這些熒光分子合成步驟復雜耗時，或使用到有毒物質。因此，尋找一種快速、簡單且安全的方法檢測汞離子非常有意義。

貴金屬納米簇(金納米簇、銀納米簇、鉑納米簇、銅納米簇)由于具有優異的熒光性質、較低的毒性和良好的生物相容性等優點，廣泛應用于疾病診斷、細胞成像、環境監測和生物傳感等領域[5-6]。其中，金納米簇因其優良的光學穩定性、光學催化性質備受科學研究者的青睞。有報道以牛血清蛋白(BSA)為穩定劑和還原劑[7]，合成發紅光的金納米簇(BSA-AuNCs)，并用于汞離子的檢測。有研究[8]合成了強熒光的谷胱甘肽(GSH)包覆的金納米簇檢測汞離子。蔡宇玲等[9]利用GSH-AuNCs構建紙型便攜式器件實現對汞離子的可視化分析。最近，Wang等[10]發現，富含腺嘌呤(A)的單鏈DNA可以作為合成金納米簇的模板(聚A-金納米簇)。相對于以生物大分子為模板合成的金納米簇，聚A-金納米簇制備過程簡單，快速，僅需30 min(BSA-AuNCs[7]： 12 h/GSH-AuNCs[8-9]： 24 h)，且熒光強度可以通過聚A鏈DNA的長度來調節?；诰跘-金納米簇的超小尺寸、優良的熒光性能、良好的光學穩定性、合成簡單，聚A-金納米簇成功應用于對蛋白質、小分子和核酸等物質的檢測[10-12]。

本文提出了一種檢測Hg2+的新方法。利用富含腺嘌呤(A)的單鏈DNA為模板合成的金納米簇作為熒光探針，由于Hg2+和金強烈的親和作用，導致金納米簇熒光信號猝滅。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

A15寡聚核苷酸鏈購自上海生工生物工程公司。硝酸汞購自上海百靈威科技有限公司。檸檬酸鈉、氯金酸(HAuCl4)由北京鼎國生物技術公司提供。所有試劑均為分析純，實驗用超純水(電阻大于18. 25 MΩ)。

Cary Eclipse 熒光分光光度計(美國安捷倫公司)，激發波長設定為280 nm，激發狹縫和發射狹縫分別設定為5.0和10.0 nm。

1.2 熒光金納米簇的合成

聚腺嘌呤-金納米簇的制備參照文獻[10]略有修改： 將600 nmol·L-1的A15-ssDNA溶液、2 mmol·L-1檸檬酸鈉(pH 6.0)、50 μmol·L-1HAuCl4加入到離心管中，然后加超純水補充體積至1 mL。室溫下混勻后，將混合物置于85 ℃下孵育30 min，即可得到熒光金納米簇。制備好的金納米簇置于4 ℃冰箱中避光儲存，以備實驗使用。

1.3 汞離子的檢測

在200 μL反應體系中，將不同濃度的硝酸汞溶液加入到10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和100 μL制備好的金納米簇溶液中，混勻后，即可測定熒光強度。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

檢測汞離子的實驗原理如圖1所示。根據文獻[13]報道，金與腺嘌呤N7位上的氮原子具有強烈的親和作用。本文選擇聚A單鏈DNA作為模板，HAuCl4為金源，以檸檬酸鈉為還原劑。在pH為6的條件下，Au3+被檸檬酸鈉還原成Au0，并富集在A15單鏈DNA上，形成具有強熒光的單鏈金納米簇。當汞離子存在時，可以有效地猝滅金納米簇的熒光。這可能是由于以Poly A為模板合成金納米簇的過程中，產生了中間體Au+。Hg2+與Au+之間強烈的噬金屬作用，破壞了金納米簇的結構，導致金納米簇熒光強度降低。

圖1 基于A15-ssDNA金納米簇檢測Hg2+的原理圖Fig.1 Schematic representation of a Hg2+ sensor based on A15-ssDNA AuNCs

2.2 金納米簇的表征及熒光響應行為

圖2(a)是A15-ssDNA金納米簇的透射電子顯微鏡(TEM)照片合成的金納米簇為球形，分散性良好，平均粒徑大約為7 nm。圖2(b)是金納米簇的熒光激發和發射光譜。如圖5所示，金納米簇在280 nm的紫外光激發下，在471 nm處出現強的熒光發射峰。圖2(c)是汞離子存在與否的熒光發射光譜圖。曲線a是A15-ssDNA金納米簇的熒光光譜，可以看出在471 nm有一強的熒光發射峰。加入50 μmol·L-1的Hg2+后，金納米簇的熒光被有效猝滅(曲線b)，說明Hg2+與金納米簇存在強烈的相互作用，金納米簇的熒光被猝滅。以上結果表明，利用金納米簇熒光強度的變化檢測汞離子的方法是可行的。

圖2 (a) DNA-AuNCs的電鏡照片; (b) DNA-AuNCs的熒光激發和發射光譜; (c) DNA-AuNCs的熒光光譜 a： AuNCs； b： AuNCs+Hg2+Fig.2 (a) TEM images of DNA-AuNCs; (b) The Fluorescence excitation and emission spectra of AuNCs; (c) Fluorescence emission spectra of AuNCs under different conditions a： AuNCs； b： AuNCs+Hg2+

2.3 實驗條件優化

圖3(a)反映了不同pH值的緩沖溶液對傳感器性能的影響。由圖可知，緩沖溶液的pH值對不加汞離子(a)與加汞離子(b)的金納米簇的熒光強度影響不大。但是pH值為7時背景略低于其他的pH值。故選取pH值為7作為后續實驗的緩沖體系。

實驗還考察了Hg2+與金納米簇反應所需的時間。從圖3(b)可知，當加入20 μmol·L-1Hg2+至金納米簇溶液中，熒光強度在1 min之內迅速下降并趨于平緩。說明Hg2+與金納米簇反應非常迅速。故后續實驗中，僅需將溶液簡單混合均勻后，即可進行熒光檢測。

圖3 (a)緩沖溶液pH的優化： (a) AuNCs； (b) AuNCs+Hg2+； (b)反應時間的優化Fig.3 (a) Effects of the pH in the absence (a) and presence of Hg2+ (b)； (b) Effects of the reaction time

2.4 傳感器的分析性能

在優化的實驗條件下，對0.01～50 μmol·L-1范圍內的Hg2+進行了檢測，結果如圖4(a)所示。由圖可知，隨著Hg2+濃度的增大，金納米簇的熒光強度逐漸降低。圖4(b)為471 nm處熒光強度與Hg2+濃度的校正曲線圖(F0與F分別為不加汞離子與加汞離子的金納米簇的熒光強度)。由圖可知，熒光強度和Hg2+濃度在0.01～1 μmol·L-1范圍內呈良好的線性關系，用空白的三倍標準偏差原則確定檢測下限為3 nmol·L-1。該方法檢測Hg2+的靈敏度比之前文獻[14-16]報道的熒光傳感器的靈敏度高。

圖4 (a)不同Hg2+濃度對應的熒光發射光譜圖(從上至下： 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 5, 10, 20, 50 μmol·L-1); (b)熒光強度與Hg2+濃度的線性關系, 插圖： 校正曲線; (c)選擇性考察，Hg2+： 20 μmol·L-1； 其他金屬離子： 50 μmol·L-1

表1 自來水中Hg2+檢測的加標回收率Table 1 Recovery of the biosensor for determinationof Hg2+ in tap water samples

為了證明該方法對Hg2+檢測的特異性，實驗選用其他可能產生干擾的金屬離子進行了考察，如Cu2+，Mg2+，Ca2+，K+，Pb2+，Mn2+，Ag+，Fe3+。從圖4(c)中可以明顯看出，只有Hg2+的加入導致金納米簇的熒光信號顯著降低，其他金屬離子的加入對金納米簇的熒光信號并無明顯影響。說明該方法對Hg2+的檢測具有高選擇性。

采用標準加入法測定了自來水樣中加入的Hg2+。由表1可知，Hg2+的加標回收率在95.33%～103.8%之間，相對標準偏差(RSD)不大于4%。表明該方法具有很好的可靠性和準確性，可用于實際樣品中Hg2+的檢測。

3 結 論

以A15-ssDNA金納米簇為熒光探針，基于Hg2+與納米金強烈的親和作用，從而猝滅金納米簇熒光，設計了一種新型的、快速的、非標記的傳感策略用于汞離子的高靈敏性和高選擇性檢測。作為熒光探針，A15-ssDNA金納米簇擁有良好的生物兼容性、優異的熒光性能和光學穩定性。同時，該方法僅需將溶液簡單的混合，操作簡單、快速。此外，該方法在0.01～1 μmol·L-1之間可以高靈敏的檢測汞離子，檢測下限達到3 nmol·L-1，且方法的選擇性好，可以滿足對實際樣品中Hg2+的檢測需求。