聚多巴胺原位還原銀納米增強碳點熒光自組裝納米復合膜用于檢測葛根素研究

翁文婷，王思玉，莊君陽

泉州師范學院化工與材料學院，福建 泉州 362000

引 言

葛根素(Pueraria，Pue)亦稱為葛根黃素。是我國傳統名貴中草藥葛根中分離出來的一類異黃酮類衍生物。葛根素具有退熱、鎮靜和使冠狀動脈血流量增加的作用，臨床上可用于提高免疫、增強心肌收縮力，保護心肌細胞，降血壓等作用。近幾年研究發現葛根素對肝損傷修護和骨質疏松癥的抑制也有很好療效[1-2]。葛根素在血管疾病治療中有重要性，準確測定葛根素含量可保證葛根素制劑的藥品質量。葛根提取物的含量測定收錄于在《中華人民共和國藥典》(2015年版)(一部)，為高效液相色譜法[3]。此方法雖靈敏，但是儀器設備昂貴、操作繁瑣且需使用大量溶劑。采用其他色譜方法測定葛根素的含量，均是建立在葛根素的紫外吸收特性的基礎上，檢測靈敏度受限。也有報道主要采用聯用技術來實現葛根素的快速靈敏檢測[4]。但這些方法均存在儀器條件要求較高或檢測干擾較大等問題。尋找操作簡單，穩定性高和線性范圍寬的葛根素檢測方法具有重要意義。

熒光光譜分析法儀器設備簡單，操作簡便，靈敏度高。利用葛根在弱堿性溶液環境下的弱熒光性質可以實現對其含量的直接熒光分析檢測，結合固相萃取前處理方法可采用高效液相色譜法明顯提高檢測靈敏度，用于體內樣品中藥物含量的檢測[5]。然而，葛根素是一種弱熒光物質，其內源熒光很弱。當外界條件發生改變，如在不同酸度、不同溶劑中以及入射光源的波長等，都會導致葛根素熒光強度的變化，影響到檢測方法的穩定性。為此，人們轉向研究采用熒光探針間接測定葛根素含量的新方法。

隨著納米技術的發展，光學性能穩定、表面積大、制備工藝簡易且水溶性良好的量子點熒光探針的出現，為研發低成本，低污染的中藥成分檢測方法提供良好的手段。Qu等[6]以量子點結合免疫色譜法定量檢測葛根素，檢測限為5.8 ng·mL-1。Zhang等[7]將CdTe量子點結合石墨烯制備納米復合材料作為葛根素的快速響應和高靈敏的電化學傳感器。Fan等[8]利用氧化石墨烯引發魯米諾的強化學發光，隨后信號被葛根素抑制而建立化學發光(CL)方法測定中藥材和人尿樣中葛根素的含量。

基于廉價環保的碳點構建熒光傳感薄膜的方法罕見報道，可能是歸因于組裝薄膜上的量子點密度小，發光強度弱，不利于響應信號檢測的缺陷。研究表明，金屬銀納米結構的表面等離子體局域電磁場可激增特定距離處發光體的信號，即表面增強熒光(surface enhanced fluorescence, SEF)效應，并成功應用于表面增強拉曼光譜[9]和熒光光譜。結合具有粘附性能和還原特性的聚多巴胺，可在光滑的玻璃表面獲得增強因子高、重復性和穩定性好的銀納米基底[10-13]。

本文以胱氨酸和檸檬酸為碳源，采用水熱法制備的熒光碳點(fluorescent carbon dots, FCDs)為研究探針。利用多巴胺堿性溶液的自聚成膜過程中同步還原硝酸銀，在FTO導電玻璃上形成聚多巴胺(Polydopamine, PDA)復合銀納米(Ag nanoparteles, AgN)基底(FTO/PDA-AgN)。通過熒光光譜、紫外光譜、交流阻抗與循環伏安曲線等方法優化PDA-AgN復合膜的制備條件，探討銀納米對熒光碳點的增強效應。構建的FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs相比于未引入銀納米的薄膜熒光增強近3倍。葛根素的加入引起傳感膜外層碳點的熒光猝滅，由此建立熒光傳感膜對葛根素的檢測響應，線性回歸方程為I0/I=2.843×104cPue+1.068，相關系數r=0.9985 6，檢出限LOD=2.31×10-7mol·L-1(3 SD/K)。相比于非銀納米增強型熒光傳感膜體系的檢出限降低了1個數量級。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary eclipse熒光分光光度計(美國Varian公司)； UV-2600紫外-可見分光光度計(日本Shimazu公司)； F-7000熒光分光光度計(日本Hitachi公司)； FLS920熒光光譜儀(英國Edinburgh Instruments)； TECNAI G2 Spirit TWIN 場發射透射電子顯微鏡(美國FEI公司)； S-4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)； ZetaPALS Zeta電位及粒徑分析儀(美國布魯克海文儀器公司)； EscaLab 250XiX-射線光電子能譜儀(美國賽默飛電子公司)； Freezone 6plus真空冷凍干燥機(美國LABCONCO公司)； DHG-924OA電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏設備有限公司)。

L-胱氨酸(cystine, Cys)； 檸檬酸(citric acid, CA)； 多巴胺(dopamine, DA)； AgNO3； 三羥甲基氨基甲烷(Tris[hydroxymethyl]metyl aminomethane; Tris)； 聚二烯二甲基氯化銨(Poly[dimethyl diallyl ammonium chloride], PDDA)均為分析純，購自阿拉丁試劑有限公司； 聚苯乙烯磺酸鈉(polystyrene sulfonate, PSS)購自美國Acros試劑有限公司； 葛根素標準品購自上海如吉生物科技有限公司； 導電玻璃FTO(10 mm×20 mm，武漢晶格太陽能科技有限公司)； 其余的試劑均為分析純； 試驗所用的水為超純水。電化學實驗采用三電極體系： 以組裝膜為工作電極，鉑片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。

1.2 方法

1.2.1 熒光碳點的制備和表征

稱取0.30 g胱氨酸和0.06 g的檸檬酸，用超純水定容至6 mL，轉移至聚四氟乙烯內襯的水熱反應釜中，置于電熱恒溫干燥箱，于180 ℃下反應7 h，制備的熒光碳點記錄為FCDs。合成后的碳點溶液在10 000 r·min-1的轉速下離心10 min。收集上清液轉入透析袋連續透析24 h (截留分子量為500 Da)，以去除過量的前軀體。最后，用0.2 μm的聚四氟乙烯微孔濾膜對透析液進行過濾處理，得到純化的FCDs溶液。將溶液冷凍干燥，得淡黃色粉末。準確稱取固體粉末，用超純水配制為0.01 g·L-1溶液，置于冰箱中保存，用于光譜測定。

將上述碳點粉末在X射線光電子能譜儀上進行基團分析，采用X射線源，能量步數為181，AlKα激發。取透析處理后的熒光碳點溶液滴到銅網的多孔碳膜上，烘干后，采用場發射透射電子顯微鏡觀察碳點的形貌，加速電壓為40～120 kV，放大倍率為10～50萬倍。所得圖像使用Nano measure軟件分析處理。用Zeta電位儀(He-Ne激光器激發)表征碳點在溶液中的表面電荷狀態和水合粒徑。將碳點溶液置于熒光分光光度計上測量熒光光譜。設置測量參數如下： Ex=350 nm； ExSlit/EmSlit=5.0 nm/5.0 nm； 發射光譜掃描范圍： 360～600 nm； Scan rate=1 200 nm·min-1。用FLS920型穩態/瞬態熒光光譜儀測試碳點的熒光量子產率和熒光壽命。熒光量子產率采用積分球相對法擬合而得。采用nF920納秒燈為激發光源，使用雙指數函數對熒光壽命曲線進行擬合如式(1)

Y(t)=A1exp(-t/τ1)+A2exp(-t/τ2)

(1)

式(1)中：A1和A2對應的是1和2個過程中時間分辨衰減權重；τ1和τ2分別為第1和2個過程的壽命。

最終熒光壽命值按如式(2)計算

(2)

1.2.2 PDA-AgN復合膜的制備及表征

聚多巴胺原位還原銀納米復合膜的制備過程如圖1所示，將FTO玻片導電面朝上平鋪在培養皿中，分別用丙酮、超純水、無水乙醇溶液沒過玻片表面，超聲洗滌10 min，保證表面潔凈，浸入新制Piranha溶液(98% H2SO4∶30% H2O2=7∶3,V/V)超聲洗滌30 min，最后用超純水多次超聲清洗，氮氣吹干。

準確移取1 mL DA水溶液加入5 mL pH 8.5的Tris-HCl緩沖溶液，再用純水定容至10 mL為組裝液。緩慢加入培養皿中，沒過玻片表面，常溫下靜置5 h，形成FTO/PDA膜。取出用氮氣吹干后，加入3.0 g·L-1的硝酸銀水溶液沒過FTO/PDA基底的表面，置于通氮除氧的環境組裝2 h，取出用氮氣吹干，制得FTO/PDA-AgN復合膜基底，置于真空干燥器保存。

以FTO/PDA作為空白，以FTO/PDA-AgN為樣品，掃描200～800 nm范圍內AgN的吸收光譜。用掃描電子顯微鏡放大1萬倍進行形貌觀察，電壓1.0 kV。分別以FTO，FTO/PDA和FTO/PDA-AgN為工作電極，置于含有5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol·L-1KCl底液中，掃描頻段為0.01 Hz～100 kHz，振幅為0.005 A條件下進行電化學交流阻抗譜實驗。使用ZSIMDEMO軟件擬合電子傳遞Ret。并以100 mV·s-1掃描速度于-0.6～1.0 V進行循環伏安曲線掃描。計算還原峰電位值Epc和氧化峰電位值Epa，兩者之差記為ΔEp。

1.2.3 表面增強熒光傳感膜的制備及表征

增強型傳感膜制備及對葛根素的響應流程如圖1所示，將FTO/PDA-AgN放入1% (V/V) 的PDDA溶液中組裝1 h，取出后用超純水清洗，恒溫恒濕箱中晾干； 再置于1 g·L-1的PSS溶液中組裝1 h，同樣操作進行清洗和晾干； 重復該過程n次，就得到FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]n自組裝膜。再浸入在熒光碳點溶液中3 h，取出后用氮氣吹干后即得到熒光增強傳感膜FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]n/FCDs。

采用S-4800掃描電子顯微鏡進行表面形貌分析，掃描電壓1.0 kV。激光共聚焦顯微圖片采用Leica TCS SP8激光共聚焦熒光顯微鏡進行測試，根據碳點的最佳熒光發射波長選擇405 nm激發光源。用自制玻片固定裝置將熒光自組裝膜樣品固定于石英四面比色皿內，調整合適的角度，使玻片組裝面與入射光的夾角約為50°，進行熒光光譜測定。熒光光譜和熒光壽命曲線的掃描參數同1.2.2。

圖1 聚多巴胺原位還原銀納米熒光增強型自組裝膜的構建及葛根傳感示意圖Fig.1 Schematic illustration of fabrication strategy of SAMs for detection of Pueraria

1.2.4 葛根素含量的檢測

通過優化實驗表明傳感膜在中性液體環境中較為穩定，結合前期碳點的性能實驗結果。選擇pH 7.20的Tris-HCl緩沖溶液為液體環境。將FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs玻片固定于2 mL緩沖溶液的熒光比色池中，待膜的熒光信號穩定后，用微量進樣器依次加入不同濃度的葛根樣品待測液，并混勻，穩定5 min后，測熒光光譜。同時，按照上述步驟對FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs進行對照試驗。

2 結果與討論

2.1 熒光碳點的制備及表征

按實驗方法制備并純化碳點溶液進行紫外光譜和熒光光譜掃描，結果如圖2(a)所示，FCDs水溶液的最大紫外吸收峰出現在330 nm。熒光光譜的最佳熒光激發發射峰為Ex/Em=350 nm/430 nm，溶液在紫外燈下呈現明亮的藍色熒光。改變不同波長的激發光源，該碳點的發射峰位置在短波光源下較為穩定，在大于最佳激發波長的光源照射下發生明顯紅移。碳點溶液的性能測試結果表明，在pH 6～11范圍內都呈現穩定的熒光發射，但是在pH小于5.0條件下熒光強度急劇下降并且發射峰位置發生了20 nm的移動，說明該碳點不適合在較酸性的溶液環境中穩定存在，這將為后期熒光膜的組裝條件提供參考。FCDs的熒光衰減曲線采用雙指數函數擬合后平均熒光壽命約為(10.75±0.08) ns，見圖2(b)所示。同時，測得熒光量子產率可達到61.7%。這些光譜特性與文獻報道的N，S摻雜碳點的實驗結果相似[14]。

圖2 FCDs溶液的(a)紫外-可見吸收光譜，熒光光譜和(b)熒光衰減曲線Fig.2 (a) The fluorescence, UV-Vis absorption spectra and (b) Decay curve of FCDs solution

圖3 FCDs的(a) XPS全譜，(b) C(1s)譜，(c) O(1s)譜，(d)N (1s)譜，(e) S(2p)高分辨XPS能譜和 (f)透射電鏡圖像； 內插圖為FCDs所對應的粒度分布直方圖

為了進一步探究碳點的結構組成，采用XPS、TEM和粒度儀對碳點進行形貌表征。結果表明，碳點在水溶液中表面呈現負電荷狀態。XPS電子能譜表征結果如圖3(a—e)所示，分別在283.98，399.98和529.98 eV處出現代表C(1s)，N(1s)和O(1s)的特征峰。CDs中所含C，N，O和S元素組成的比例，說明胱氨酸的氨基和巰基在碳點合成過程中嵌入碳點表面N、S摻雜型的CDs。TEM是碳點形貌的最常用表征手段，將純化后的碳點溶液滴加在銅網上，并用紅外燈將其烘干，對其進行了透射電鏡的表征。從圖3(f)可以看出，碳點的分散性很好，大小均一并具有類球狀形貌。內插圖顯示的是，經高斯曲線擬合得到的顆粒分布圖(計算約100個納米顆粒的平均值)，碳點的平均粒徑約為2.45 nm。

2.2 FTO/PDA膜組裝條件優化及表征

按照實驗方法配制堿性多巴胺溶液，測試其光譜變化，跟蹤其自聚合過程。實驗結果如圖4(a)和(b)所示，多巴胺單體在228和278 nm處有精細結構的紫外吸收峰，并且在320 nm處呈現藍色熒光發射峰。多巴胺分子在堿性溶液環境中，容易自身氧化成醌結構，進一步環化后成吲哚類聚合物，導致紫外吸收峰消失。對應形成的聚多巴胺膜也沒有熒光特性，不會對后期熒光自組裝膜體系造成背景干擾，說明多巴胺在固體表面上形成基底膜的可行性和穩定性。

分別以FTO和FTO/PDA為工作電極，測試PDA膜的循環伏安和交流阻抗曲線。結果如圖4(c)和(d)所示，PDA膜形成前后的電化學性質有明顯不同，循環伏安曲線的氧化還原峰的電位差ΔEp變大，對應的Nyquist圖上高頻區半圓增大，表明形成的聚多巴胺膜阻礙的溶液中[Fe(CN)6]3-/4-的電荷傳遞到電極的過程，進一步表明了FTO/PDA膜的形成。通過電化學實驗結果優化組裝條件，確定在pH 8.5 Tris-HCl緩沖溶液的2.0 g·L-1多巴胺溶液中，浸泡3 h后，就可形成穩定的聚多巴胺薄膜。

2.3 FTO/PDA-AgN膜組裝條件優化及表征

在FTO/PDA膜的基礎上，按照實驗方法制備FTO/PDA-AgN，通過掃描電鏡和紫外吸收曲線跟蹤膜上AgN的形成過程。結果如圖5(a)所示，隨著浸泡硝酸銀溶液的時間延長，形成的聚多巴胺復合銀納米膜在440 nm的紫外吸收峰位置發生藍移，并且吸光度逐漸增強，6 h時在430 nm處具有最窄的峰型。銀納米的紫外吸收峰均說明此時形成銀納米顆粒粒徑分布最為均勻[13]。同樣的實驗也設計進行不同銀離子濃度的優化，并考察聚多巴胺膜的形成條件對銀納米的粒徑分布的影響。按照實驗方法，在此基底上制備增強型自組裝膜FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs，其熒光光譜結果如圖5(b)所示，當浸泡為6 h時，膜的熒光強度也達到最大。因此，結合膜的熒光增強效應，優化可得FTO/PDA-AgN膜的最佳形成條件是將FTO/PDA在3 g·L-1的AgNO3溶液中浸泡6 h。對應的掃描電鏡圖片及其能譜分析如圖5(c)和(d)所示，進一步驗證了銀離子在聚多巴胺膜上原位還原，形成納米Ag顆粒。連續10 h觀察銀納米的紫外光譜，吸收峰位置沒有發生明顯變化，說明此方法制得的納米Ag顆粒具有較好的穩定性。

圖4 pH 8.5 Tris-HCl溶液中1.0 g·L-1 DA溶液和聚多巴胺膜的(a)紫外-可見吸收光譜和 (b)熒光光譜圖及成膜前后的(c)循環伏安曲線與(d)交流阻抗圖

2.4 熒光增強膜的組裝及機理研究

根據實驗方法，通過PDDA和PSS聚電解質分子的靜電吸附作用，將引入銀納米前后的基底進行層層自組裝，構建不同聚電解質間隔層數的熒光增強膜FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]n/FCDs和FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]n/FCDs(n代表PDDA/PSS雙層膜的層數)。熒光光譜結果如圖6所示，隨著組裝間隔層數的增加，制備的自組裝膜的熒光強度也增加，當n=3層時，相比于FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs自組裝膜，FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs的熒光強度增強效果最明顯，表明銀納米基底對碳點熒光信號的增強效應呈現出一定的距離依賴性。

通過激光共聚焦顯微鏡對增強型自組裝膜進行熒光信號表征。實驗結果如圖7(a)和(b)所示，在同一條件下，引入銀納米的FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs SAMs的發光性能明顯強于FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs SAMs。

將這兩種自組裝膜進行熒光壽命的驗證。熒光衰減曲線如圖7(c)所示，通過擬合計算，FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDsSAMs的熒光平均壽命為6.084 ns，而FTO/PDA-AgN/[PSS/PDDA]n/CDsSAMs的熒光壽命僅為2.983 ns。說明銀納米基底對碳點熒光信號的增強也伴隨著輻射衰減率的增加。由此，可推測銀納米對碳點熒光增強機理如局域表面等離子體共振效應的作用。

2.5 熒光增強膜對葛根藥物的傳感分析

由于葛根分子對傳感膜上碳點的熒光信號具有猝滅效應，按實驗方法建立FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs測定葛根含量的分析方法。結果如圖8(a,b)所示，在3.33×10-7～1.50×10-5mol·L-1范圍內，熒光信號猝滅程度與加入的葛根標準品濃度呈良好的線性關系，測定的線性方程為I0/I=2.843×104cPue+1.068，相關系數為r=0.998 56。檢出限為2.31×10-7mol·L-1(3 SD/K)，其中K為工作曲線的斜率2.843×104，RSD為10次空白試驗值0.218 9%。檢測靈敏度相比于FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs的線性響應方程為I0/I=2.625×103cPue+0.949 9 (r=0.988 49)，檢測限提高了近一個數量級。

圖6 不同間隔層數條件下制備的FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs(紅色)和 FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs(黑色)自組裝膜的熒光光譜圖Fig.6 The fluorescence spectra of FCD-adsorbed SAMs with (red) and without (black) AgN as a function of spacer (PDDA/PSS)n (n=1～5) bilayers

圖7 (a) FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs，(b) FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs自組裝膜的激光共聚焦顯微圖片及(c)熒光衰減曲線

圖8 (a) FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs對葛根素的熒光傳感分析； (b) FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs(黑)和FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs (紅)傳感膜的線性擬合曲線

3 結 論

以胱氨酸和檸檬酸為碳源，采用180 ℃一步水熱法合成氮硫摻雜結構的碳點。該藍色熒光碳點呈內徑約3 nm的球狀結構，并具有61.7%的高熒光量子產率。借助堿性多巴胺的粘附性能和還原性能，在聚多巴胺膜形成過程中同步進行銀離子的化學還原，得到聚多巴胺復合銀納米基底。此法操作簡易，相比于溶液相制備銀納米方法，可有效彌補納米粒子易團聚氧化的缺陷。以水熱法合成N, S摻雜的藍色熒光碳點作為研究對象，采用自組裝技術精確控制基底和FCDs之間的距離，構建的增強熒光型傳感薄膜FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs，銀納米膜表面的碳點熒光信號增強了近三倍。熒光增強現象呈現出明顯的距離依賴性，并導致輻射衰減率的增加, 熒光壽命明顯降低?？赏茰y銀納米對膜表面碳點的熒光增強是基于金屬納米的局域等離子體共振效應。熒光增強型傳感膜可用于測定葛根藥物的含量，檢出限為2.31×10-7mol·L-1，相比無銀納米的熒光傳感膜的檢出限4.216×10-6mol·L-1，檢測靈敏度提高了近一個數量級。