腹瀉型腸易激綜合征動物模型建立及評價

賀 星，劉 衛，唐 郡，朱 斌，李 超，鄭 巖，崔立紅

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○一醫院消化內科，安徽 合肥 230031； 2.中國人民解放軍總醫院第六醫學中心消化內科

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種常見的功能性腸病，其主要癥狀是反復出現的與腹痛相關的排便異常[1]。IBS的發病機制復雜多樣，胃腸動力和感覺異常是其病理生理基礎[2]，其發病與腦-腸軸功能改變有關[3]，是一種生物-心理-社會障礙，因此構建動物模型存在一定的困難。IBS的分型中腹瀉型IBS(diarrhea-predominant IBS, IBS-D)最常見[4-5]，相關動物模型研究也最多[6]，但目前仍無法完整的復制該疾病，缺乏完美的IBS-D動物模型。本研究結合相關報道和課題組前期經驗，采用急-慢性應激結合的方法構建IBS-D大鼠模型，通過精神和軀體雙重應激改變大鼠的腸道動力和敏感性模擬IBS-D的發病，取得良好效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選擇20只SPF級雌性Wistar大鼠為實驗動物[7-8]，體質量(160±10)g，購自北京科宇動物養殖中心，平衡飼養3 d后用于實驗。實驗前1周使大鼠適應實驗環境，大鼠均被安置在獨立代謝籠內。實驗過程中，除非特殊干預，一直供應大鼠標準飲食及自來水，溫度控制在(22±2)℃，并保持12 h/12 h照明/黑暗節律。將20只大鼠采用隨機數字法分為模型組和對照組，每組10只。模型組：接受急-慢應激法構建IBS-D大鼠模型，對照組：正常飼養，不接受任何干預及處理。

1.2 實驗儀器及試劑光源實時控制儀(CHNT)；電熱恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司，DH5000)；動脈夾(北京合理科創，DMJ-1.6)；水平振蕩器(金壇市城西崢嶸實驗儀器廠，SHZ-82)；電子天平(METTLER、TOLEOD)；大鼠固定器(北京搏貝科技有限公司，BB-500GB)；自制AWR閾值檢測儀器(血壓計、導尿管、灌胃針及無菌手套)；全封閉組織脫水機、組織包埋機型號、切片機、顯微鏡由我院病理科提供；10%水合氯醛(河北藍夢生物科技有限公司)；2.5%戊二醛(北京天悅基因有限公司，200 ml)；二甲苯、石蠟、Ehrish蘇木精、10%甲醛、伊紅酒精染色劑、中性樹膠等由我院病理科提供。

1.3 造模方法急-慢應激法[9]：給予Wistar大鼠以下刺激，夜間連續照明12 h，45 ℃悶熱的環境中5 min(見圖1A)，禁水24 h，4 ℃寒冷的環境中3 min(見圖1B)，夾尾1 min(見圖1C)，水平振動(120次/min)，40 min(見圖1D)和食物剝奪24 h。每周按照隨機順序給予模型組上述刺激，每連續2 d給予的刺激順序不能重復，避免大鼠能夠預知刺激的發生，連續3周，然后休息1周。再給予紙帶束縛前肩、前上肢、胸部，限制前上肢搔抓頭面部，但不限制其活動(見圖1E)，束縛時間為1 h。

圖1 急-慢應激刺激圖示 A：悶熱刺激；B：冷刺激；C：夾尾應激；D：水平震蕩；E：急性束縛應激； F： 避水應激Fig 1 Acute-chronic stress A: stuffy stimulation; B: cold environment; C: tail clamp; D: level vibration; E: acute restraint stress；F: water avoidance stress

1.4 檢測指標

1.4.1 大鼠體質量：使用電子天平對兩組大鼠進行稱重并記錄數值(g)。

1.4.2 蔗糖水攝入量[10]：在模型制備前，對所有大鼠進行1%蔗糖水攝入訓練，訓練方法：連續48 h給予大鼠自由攝入1%蔗糖水，然后24 h的禁水處理，最后測量1 h內1%蔗糖水攝入量(ml)。

1.4.3 1 h排便量：采用避水應激法[11]測量大鼠排便量(見圖1F)。實驗設備由透明有機玻璃容器(45 cm×25 cm×25 cm)和固體平臺(10 cm×8 cm×8 cm)組成，平臺置于玻璃容器底部，玻璃容器中裝入室溫水，高度為距離平臺頂端1 cm，將大鼠置于平臺上，使其對水產生心理應激反應，促進大鼠排便。觀察記錄其1 h排便粒數(干便)或次數(稀便)。于實驗28～30 d連續記錄5次數值，取平均值。

1.4.4 稀便率：通過濾紙印記判斷濕便次數[9]，記錄24 h內大便總次數、濕便次數，根據濕便次數及大便總次數計算稀便率。稀便率=濕便次數/大便總次數×100%。于造模后記錄模型組、對照組大鼠稀便率。

1.4.5 腸道敏感性：采用檢測大鼠腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)壓力閾值(mmHg)的方法檢測大鼠腸道敏感性(見圖2A)[12]。大鼠禁食12 h，不禁水。將大鼠置于固定器內，石蠟油潤滑后將氣囊插入肛門約6 cm，膠布固定防止滑脫。蘇醒后適應20 min，血壓計恒速向氣囊注氣加壓，當大鼠出現腹部肌肉收縮(AWR評分2分)(見圖2B)，此時壓力為疼痛壓力閾值[13]。

圖2 AWR壓力閾值檢測方法(A)及AWR評分示意圖(B)Fig 2 Detection method of AWR pressure threshold(A) and AWR score diagram(B)

1.4.6 HE染色觀察結腸組織結構[14]：處死大鼠后，收集遠端結腸，沖洗并固定在10%甲醛。然后經連續清潔和脫水處理結腸組織，并包埋在石蠟塊中。最后將結腸組織切成薄片并進行標準HE染色。由病理科專業人員使用奧林巴斯光學顯微鏡放大40倍觀察大鼠乙狀結腸黏膜上皮的完整性，有無組織缺損、糜爛、水腫及潰瘍。

2 結果

2.1 兩組大鼠1 h排便量和濕便率比較造模后，比較兩組大鼠1 h排便量，模型組(7.14±0.84)?；虼?h明顯高于對照組(0.82±0.42)?；虼?h，差異有統計學意義(t=21.281，P=0.000)；模型組大鼠濕便率(12.15±0.85)%明顯高于對照組(0)，差異有統計學意義(t=45.202，P=0.000)(見表1)。

表1 兩組大鼠1 h排便量和濕便率比較Tab 1 Comparison of defecation number and wet feces rate between two groups of rats

2.2 兩組大鼠造模前后疼痛壓力閾值(AWR 2分)、糖水攝入量及體質量比較造模前，模型組與對照組大鼠疼痛壓力閾值、蔗糖水攝入量及體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)；造模后，模型組大鼠疼痛壓力閾值、蔗糖水攝入量及體質量明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=13.123，P=0.000；t=7.600，P=0.000；t=9.434，P=0.000)(見表2)。

表2 兩組大鼠造模前后疼痛壓力閾值、蔗糖水攝入量及體質量比較Tab 2 Comparison of pain pressure threshold, sucrose water intake and body weight between two groups of rats before and

2.3 兩組大鼠腸道組織HE染色光鏡下結果HE染色光鏡下顯示，兩組大鼠結腸黏膜均未見明顯水腫、糜爛、潰瘍、出血，固有層內無中性粒細胞浸潤，間質無明顯水腫(見圖3)。

圖3 兩組大鼠結腸黏膜光鏡下表現(HE染色，40×) A: 對照組； B： 模型組Fig 3 Intestinal mucosal structure under light microscopy (HE staining,40×) A： control group; B: model group

3 討論

IBS是一種常見的功能性腸病，在人體內的病理生理學尚不完全清楚，因此通過動物模型成功鑒定IBS癥狀改善的分子生物學基礎，對于其臨床前和轉化研究十分重要[15]。目前研究常用的動物模型主要針對IBS-D，包括束縛應激模型、母嬰分離、避水應激模型、多因素精神應激模型、結直腸擴張、感染后腸易激綜合征(post-infectious IBS，PI-IBS)動物模型、理化刺激模型及轉基因模型[16-19]，均從一定程度上構建出IBS-D的內臟敏感和動力異常特征，但仍無法完整復制疾病特點。本研究采用的應激方式涵蓋睡眠、飲食、運動、感知及情緒方面，旨在通過反復中小強度的多因素刺激使大鼠通過“腦-腸軸”達到一種應激與適應相對平衡狀態，即IBS-D狀態，從而短暫模擬人類IBS-D患者病理生理。結果發現，通過28 d的慢性應激+1 d的急性應激后，所有大鼠均無死亡，模型組大鼠在排便次數、稀便率、蔗糖水攝入量、體質量、疼痛壓力閾值等方面出現IBS-D樣變化，效果明顯且安全可行。

造模完成后，課題組首先分析兩組大鼠1 h排便量和濕便率，對應IBS-D癥狀中的排便次數增加和稀便。本研究采用避水應激方法檢測1 h排便量，可以模擬IBS-D在應激時排便增多的特點，主要反映大鼠的腸道動力和敏感性；采用的濾紙印跡法可以精確反應大鼠濕便次數，濕便率升高與腸道黏膜屏障功能障礙有關。研究發現，模型組大鼠1 h排便量和濕便率均高于對照組，該結果提示從癥狀角度，IBS-D大鼠模型構建成功。但本研究的IBS-D大鼠濕便率并未達到IBS-D定義的25%[20]，該結果考慮與本實驗采用判斷濕便的方法(濾紙印記)以及大鼠本身的生理特征有關。

其次，為了直觀地觀察大鼠腸道敏感性，本研究使用目前公認的AWR評分進行判斷[21]。觀察大鼠疼痛壓力閾值，發現IBS-D大鼠AWR 2分壓力閾值明顯低于正常大鼠，提示IBS-D大鼠腸道敏感性低于正常大鼠，從腸道敏感性角度提示大鼠造模成功。

另外，為明確模型組大鼠情緒狀態，課題組對兩組大鼠的蔗糖水攝入量進行研究。蔗糖水攝入量是判斷大鼠抑郁情緒的一種手段[9]，蔗糖水攝入量降低代表大鼠快感缺失。本實驗結果顯示，模型組大鼠蔗糖水攝入量明顯低于對照組大鼠，提示模型組大鼠存在情緒障礙，體現出腦-腸軸在IBS-D發病中的作用。

本研究同時分析了大鼠的體質量動態變化，發現兩組大鼠體質量均呈升高趨勢，但受到應激刺激的大鼠體質量增長幅度較小，造模成功后體質量明顯低于對照組，考慮與大鼠處于應激狀態及排便量多有關。體質量方面的差異與人類IBS患者特點有所差異，原因可能大鼠是適應應激方面與靈長類動物尚存在差距，提示動物模型還有待完善。

本研究重點對兩組大鼠顯微結構進行了觀察，結果通過40倍光鏡下觀察并未發現水腫、糜爛、潰瘍、出血以及炎性細胞浸潤，符合IBS-D腸道組織無器質性病變的特點[22]，從該角度分析造模成功。

綜上所述，急-慢刺激后的大鼠在腸道癥狀、動力及感知、情緒障礙、顯微結構方面與IBS-D發病特點一致，是一種安全有效的IBS-D造模方法。