駐景丸治療糖尿病視網膜病變網絡藥理學研究

薛 屹，孫向明，胡 揚，劉博男，宋 輝，凌 娜，李文蘭*

(1. 哈爾濱商業大學 藥學院，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業大學 藥物工程技術研究中心，哈爾濱 150076)

糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是常見的糖尿病并發癥之一，發病取決于糖尿病患者血壓、血脂、血糖水平的控制情況，患病時間的長短以及糖尿病的類型等，其病變發展迅速，是糖尿病患者視力受損甚至失明的主要原因[1-3].DR按視網膜微血管逐漸發生病變情況可廣泛分為非增殖期和增殖期.增殖期新生血管增生，破壞視網膜微血管系統，嚴重時伴有黃斑水腫，導致視網膜脫落甚至失明，嚴重影響患者的健康和生活質量.目前DR的病因尚不明確且治療效果有限，因此，DR的機制及其潛在有效治療方法受到廣泛的研究[4].

駐景丸出自宋代官修方書《太平圣惠方·卷第三十三·治目昏暗方》[5].原方由菟絲子5兩(酒浸3日，曬干，別搗為末)，車前子1兩，熟干地黃3兩組成.其中，菟絲子與熟地黃皆歸于肝、腎經，兩者均具有補益肝腎、益精養血的功效.車前子歸肝、腎、肺、小腸經，有清熱明目，利尿通淋的功效[6].肝開竅于目，菟絲子、熟地黃補益肝腎精血以滋養雙目.肝腎陰虛，痰濁血瘀，濁邪害清，導致眼生翳障，視物昏花[7].車前子分清濁，利水濕，導濁水下往膀胱，可清肝熱而明目[8].三者配伍可治療糖尿病視網膜病變，但其作用機制復雜，涉及神經炎癥，氧化應激[4]，血管病變[9]等多個方面.網絡藥理學是一種綜合多學科理論闡明藥理機制的新方法，它通過對有效成分的篩選、靶標的預測和分子之間的相互作用機制來進行分析，為預測藥物治療疾病的潛在靶標和通路提供了可靠的研究背景[10].本文擬采用網絡藥理學的研究方法預測駐景丸治療DR的潛在靶標及其可能的作用機制，為今后藥理研究或藥物研發提供新思路和參考.

1 材料與方法

1.1 駐景丸成分收集與篩選

以駐景丸全方中“菟絲子”、“車前子”、“熟地黃”為關鍵詞在傳統中藥系統藥理學分析平臺TCMSP中查找所含所有成分.根據TCMSP平臺推薦的藥動學參數(Oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug-like index，DL)≥0.18 為限定條件進行篩選，同時結合文獻報道，核查合并后得到駐景丸候選活性成分.

1.2 駐景丸活性成分的靶標預測

通過TCMSP數據庫和SymMap數據庫檢索駐景丸中所篩選的活性成分的相關靶標，并通過 Uniprot 數據庫將所得到的蛋白靶標轉換成基因靶標，得到駐景丸活性成分的靶標.

1.3 糖尿病視網膜病變的靶標預測

設置關鍵詞 “Diabetic retinopathy”，利用Disgene數據庫、OMIM數據庫以及GeneCards數據庫進行檢索、合并、去重后得到DR的潛在靶標.將駐景丸活性成分的靶標和DR的潛在靶標導入Venny2.1.0中，比對得到二者的交集靶標，即為駐景丸治療DR的關鍵靶標.

1.4 駐景丸活性成分-關鍵靶標-DR網絡的構建

將駐景丸的活性成分和駐景丸治療DR的關鍵靶標導入軟件Cytoscape，以構建活性成分-關鍵靶標-DR的網絡圖，其中構建的網絡圖中“節點”(node)表示駐景丸中藥成分、中藥所含活性化合物、DR及作用靶標，“邊”(edge)表示中藥與活性成分、中藥與疾病，疾病與靶標、活性成分與靶標間的關系.

1.5 構建蛋白質互作(PPI)網絡

將駐景丸治療DR的靶標上傳至在線STRING 11.0數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”,設置最低要求互動分數為0.700，隱藏游離點，獲取相應的蛋白質相互作用關系，所得文件保存為TSV 格式.利用COUNTIF 函數計算相應靶標的Count值，所得文件保存為TXT格式.將TSV和TXT文件導入至 Cytoscape 3.6.1 軟件，根據Count值調節節點的大小、顏色，以更直觀地呈現出主要作用靶標，以及各靶標之間的相互作用關系.

1.6 GO生物學過程富集分析和KEGG通路富集分析

將駐景丸治療DR的關鍵靶標導Metascap數據庫，選擇物種為 “H.sapiens”進行custom analysis，設定閾值P<0.01，最小重疊度(Min Overlap)為3，最小富集程度(Min Enrichment)為1.5，進行GO生物學過程(GO Biological Processes)富集分析和KEGG通路(KEGG Pathway)富集分析.將排名前20的GO生物學過程富集分析結果導入QuickGO數據庫進行層級關系分析.分析平臺及數據庫見表1.

表1 數據庫及分析平臺

2 實驗結果

2.1 駐景丸活性成分篩選及活性成分靶標預測

經檢索共獲得菟絲子主要化學成分 147個、車前子176 個、熟地黃76個.設置ADME參數篩選后獲得菟絲子主要活性成分11個、車前子9個、熟地黃成分2個.經文獻報道獲得相關成分11個.匯總后保留成分唯一值共獲得活性成分31個，篩去無對應靶標成分6個，最終獲得駐景丸活性成分25個，見表2.

表2 駐景丸主要活性成分基本信息

2.2 DR靶標的預測及駐景丸治療DR的關鍵靶標的預測

通過Disgenet數據庫、 Genecards數據庫和OMIM數據庫共收集與DR相關靶標2 889個.將其與駐景丸活性成分對應的228個靶標作對比，獲得共同靶標133個，即駐景丸治療DR的關鍵作用靶標，見圖 1.

圖1 駐景丸治療糖尿病視網膜病變關鍵靶標的篩選

2.3 駐景丸活性成分-關鍵靶標-DR網絡的分析

利用Cytoscape軟件構建駐景丸活性成分-關鍵靶標-DR網絡圖，見圖2.此網絡共包括162個節點(1個疾病，3個中藥，25個化合物成分，133個關鍵靶標)、432條邊(28條中藥和化合物成分相互作用；268條化合物成分和潛在靶標相互作用；133條疾病和潛在靶標相互作用；3條疾病與中藥相互作用).其中長方形節點分別代表駐景丸中藥成分菟絲子、車前子、熟地黃；“V”字形節點代表DR；橢圓節點代表駐景丸活性成分；菱形節點代表駐景丸治療DR的關鍵靶標；線條代表相互作用關系.而圖中駐景丸每個活性成分平均可作用于10.72(268/25)個靶標，每個靶標平均連接2.02(268/133)個化合物成分.其中，菟絲子和車前子都含有化合物槲皮素(quercetin)，對應關鍵靶標94個；車前子和熟地黃都含有谷甾醇(sitosterol)，對應關鍵靶標10個.車前子中熊果酸(ursolic acid)對應關鍵靶標45個；菟絲子中山萘酚(kaempferol)對應關鍵靶標 29個；異鼠李素(isorhamnetin)對應關鍵靶標12個.DL 值最高的為芝麻素(sesamin DL=0.83)對應關鍵靶標16個.充分體現駐景丸治療DR具有多成分、多靶標的特點.

圖2 駐景丸活性成分-關鍵靶標-DR的網絡圖

2.4 蛋白質互作網絡

將獲得的133個駐景丸治療DR的關鍵靶標上傳至STRING 11.0 數據庫，獲取相應的蛋白相互作用信息.根據COUNTIF函數計算count值，將利用STRING數據庫所得的靶標相互作用關系導入 Cytoscape軟件，制作關鍵靶標相互作用網絡圖，使其可視化，最終篩選獲得關鍵靶標蛋白(圓形節點)127個，節點的面積越大，代表其count值越大；邊1146條，代表靶標之間的相互關聯，見圖 3.并篩選列舉駐景丸治療DR排名前30 的關鍵靶標，見表3.根據count值分析，可認為絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(Akt1)、白細胞介素6(IL6)、細胞腫瘤抗原P53(TP53)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、轉錄因子AP-1(JUN)、表皮生長因子(EGF)這10個靶標與駐景丸治療糖尿病視網膜病變相關性最大，推測這10個靶標為治療DR的核心靶標.

表3 駐景丸治療DR的PPI網絡關鍵靶標(排名前 30)

圖3 駐景丸治療DR的蛋白質互作網絡

2.5 駐景丸治療DR基因GO生物學過程分析及KEGG通路富集分析

將駐景丸治療DR的關鍵靶標輸入Metascape數據庫進行GO生物學過程富集分析和KEGG通路富集分析.GO富集分析(P<0.01)排行前20，見圖4，結果表明駐景丸可能通過對無機物的反應、脂多糖的反應、細胞因子介導的信號通路、對有毒物質的反應、凋亡信號通路、對細胞外刺激的反應、細胞對有機氮化合物的反應、對傷害的反應、活性氧物質代謝過程、細胞增殖或遷移等生物學過程發揮藥效.通過對排名前20的GO生物學過程進行層級關系分析，見圖5，發現其主要與刺激反應(response to stimulus)、信號通路(signaling)、生物免疫調節(biological regulation)、細胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)相關.根據KEGG 通路富集分析(P<0.01) 排行前20，見圖6，結果表明：駐景丸可能通過調控糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(見圖7)、 癌癥信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、阿米巴病、丙型肝炎、NF-κB信號通路、肌萎縮性側索硬化、胰島素抵抗等通路來治療DR.

圖4 駐景丸治療DR的關鍵靶標GO分析(排名前20)

圖5 GO生物學過程層級關系圖

圖6 駐景丸治療DR的關鍵靶標KEGG分析(排名前20)

圖7 糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路圖

3 討 論

駐景丸是治療眼科疾病的經典古方，現代臨床常采用加減駐景丸治療青少年近視[11]、眼底黃斑疾病[12]、糖尿病視網膜病變[13]等疾病.方中菟絲子，熟地黃均可滋補肝腎，車前子清肝明目，三者配伍使目得肝血能視，腎精上注目明.本研究通過 TCMSP、SymMap、Disgenet、GeneCards和OMIM數據庫分析了駐景丸3味中藥(菟絲子、車前子、熟地黃)治療DR的主要活性成分，其中槲皮素具有心臟保護、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤、抗高血壓等作用[14]，Hatice Iskender[15]等人發現其在降低血糖水平方面也發揮一定作用.Castro AJ[16]等人研究發現熊果酸可增加胰島素分泌，具有較強的抗高血糖作用.異鼠李素是槲皮素的衍生物，在不同疾病中發揮抗氧化和抗炎作用，Jamali-Raeufy N[17]等人研究發現異鼠李素可降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠血糖水平，抑制星形膠質細胞活化和乙酰膽堿酯酶活性，減輕氧化應激反應和炎癥反應，對大腦中與糖尿病引起的變化有潛在的神經保護作用.此外，芝麻素在抗高血壓、降低膽固醇、降血糖方面也顯示出一定的藥理活性[18].

葡萄糖、乳糖等還原糖可以與蛋白質的氨基發生非酶促反應，形成不穩定的schiff堿，然后形成Amadori產物.這些早期糖基化產物會進一步發生重排，脫水和縮合等復雜反應，產生 “高級糖化終產物”(AGEs).在衰老或者某些病理條件下，例如糖尿病患者，各種組織中會形成和積累大量的AGEs[19-21].有研究表明RAGE是AGEs的信號轉導受體，并且AGEs與RAGE會相互作用會激活NADPH氧化酶、蛋白激酶C和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多種細胞內信號通路，進一步激活NF-κB活性，促進IL-1、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的表達，引起血管炎癥并刺激腫瘤生長[22].在DR的早期階段，視網膜脫離的表征是微動脈瘤、血管通透性增強、視網膜增厚和硬滲出物的形成等，這些因素會導致黃斑受到影響，從而使視力下降.隨著時間的推移，視網膜缺血使Bcl-2和Bax表達非常明顯，從而上調VEGF的表達[23].VEGF過量產生，會激活AGE-RAGE信號通路[24-25]，AGEs可影響誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，在糖尿病并發癥中顯示出明顯的神經毒性和損傷作用[26-27]，進一步破壞血管-視網膜屏障，進而產生新血管，導致玻璃體出血、纖維化、牽拉性視網膜脫離甚至失明[28].

近年來，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)發病率顯著上升，眾多并發癥都與T2DM有關，包括失明，腎衰竭和心臟功能障礙等.T2DM是以胰島素抵抗(IR)、高血糖和高血脂癥為特征的一種綜合性代謝障礙.胰島素受體(INSR)/磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/ 蛋白激酶B(AKT)信號通路是一條經典的與葡萄糖攝取相關的主要途徑[29].正常情況下，胰島素可抑制Akt的磷酸化，但過多卡能量的攝入會導致游離脂肪酸積累和脂肪細胞增大，巨噬細胞化學吸引劑分泌增加，導致巨噬細胞浸潤到增大的脂肪細胞中[30]，并激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K炎癥信號通路，進一步激活NADPH，促進caspase-3的激活，導致IL6和TNFα分泌增加[29].TNFα是一種促炎性細胞因子，它在包括肥胖癥和胰島素抵抗在內的各種代謝綜合征的發作中起著至關重要的作用.TNFα分泌增加會導致慢性炎癥狀態，這可能會損傷胰島素信號通路，加重胰島素抵抗[31].同時在脂肪細胞促炎條件下，TNF-α的升高水平也會通過激活幾種Ser / Thr激酶(如：IKKβ，JNK，PKCθ，p38 MAPK等)來損害胰島素信號轉導級聯反應，從而導致血糖升高[32-33].

綜上所述，本研究運用網絡藥理學的方法研究駐景丸治療DR的機制，將所得到的133個關鍵靶標通過GO生物學過程富集分析和KEGG富集分析，得到多條與DR密切相關的通路，如：AGE-RAGE信號通路、 癌癥信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、NF-κB信號通路、胰島素抵抗等.結合GO分析，這些通路主要與刺激反應、信號通路、細胞過程、代謝過程、生物免疫調節等生物學過程相關.本研究充分體現駐景丸治療DR具有多成分、多靶標、多途徑協同發揮藥效的特點，為后續對駐景丸治療DR的研究提供參考依據和新思路.該預測結果與現有文獻報道結果高度符合，但由于現有數據庫并不完整，駐景丸仍有 5個化學式未找到相應靶標.無法確定駐景丸配伍后潛在活性成分含量、種類及藥代動力學是否發生變化.所以網絡藥理學當前僅為理論上的預測，藥物的相關機制還需要進一步進行科學驗證.