口腔鱗狀細胞癌外周血、癌組織及癌旁組織中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達及臨床意義

閆秋杰，南麗君，趙芳源，李俊冉，張媛媛

(鄭州大學第一附屬醫院 口腔科，河南 鄭州 450052)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發病例約35萬例[1]。雖然近年來OSCC的診斷方法及綜合治療不斷改進，但OSCC的5 a生存率仍僅為50%左右[2]。T淋巴細胞介導的細胞免疫在抗腫瘤反應中發揮核心作用。負性共刺激分子常位于T淋巴細胞或腫瘤細胞表面，在多種腫瘤細胞和免疫細胞上表達上調，使T淋巴細胞功能發生障礙，直接或間接促進腫瘤細胞免疫逃逸，進而導致腫瘤治療失敗。目前，針對免疫檢驗點PD-1單克隆抗體已被批準用于治療OSCC在內的頭頸部鱗狀細胞癌，然而由于患者體內免疫耐受的產生，單一的免疫治療效果并不理想。故采用聯合免疫治療來控制疾病的進展。有研究報道，T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin molecule-3，TIM-3)是大多數免疫細胞表面共抑制分子，半乳凝素-9是其配體，兩者結合后可以抑制免疫應答，從而促進腫瘤的發生[3]。已在多種腫瘤中發現TIM-3在免疫調節中發揮關鍵作用。然而，TIM-3表達在OSCC中的生物學和臨床價值尚未得到系統的闡明。本研究觀察OSCC患者外周血、癌組織及癌旁組織中T淋巴細胞上TIM-3的表達情況，并分析其臨床意義，旨在探討TIM-3與疾病的關系，為OSCC的免疫靶向治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年4月至2019年10月鄭州大學第一附屬醫院收治的41例OSCC患者作為OSCC組，其中男25例，女16例，年齡36～87歲，平均(61.24±12.91)歲。選取同時期在鄭州大學第一附屬醫院接受體檢的20例健康體檢者作為對照組，其中男13例，女7例，年齡37～83歲，平均(59.00±11.17)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。受試者知曉本研究內容并簽署同意書。本研究經鄭州大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 入組標準(1)選取標準：①首次診斷為OSCC，且經病理HE染色確診；②臨床病理資料完整。(2)排除標準：①既往放化療及免疫治療史；②非原發腫瘤，或合并其他腫瘤；③伴有其他的口腔黏膜病，如口腔白斑、口腔扁平苔蘚等；④合并其他系統性疾病。

1.3 標本采集與制備清晨空腹狀態下采集受試者2 mL外周靜脈血，置于肝素抗凝管內，2 h內上機檢測。收集手術切除的OSCC組織以及癌旁2 cm以上的正常組織標本(蘇木精-伊紅染色證實無腫瘤細胞)。樣本制備：取部分癌組織和對應癌旁組織在無菌操作臺上剪成約1 mm3的碎塊，分別加入含有鏈霉素(500 mg·L-1)、青霉素(500 IU·mL-1)及慶大霉素(900 IU·mL-1)的培養液內，并放入消化酶混合液中(體積分數為2%的胎牛血清，1 mg·L-1的CollagenaseⅠ、CollagenaseⅣ，25 mg·L-1的脫氧核糖核酸酶)消化30 min，采用100目濾網過濾溶液制備單細胞懸液。

1.4 檢測方法流式法檢測在CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達。取外周抗凝血、癌組織及癌旁組織單細胞懸液各100 μL分別置于EP管中，然后分別加入熒光標記(抗TIM-3-PE，抗FITC-CD8、抗PerCP-Cy5.5-CD4、抗APC-PD-1)抗體各5 μL至相應流式細胞管中，同型對照組各加入5 μL對應熒光標記的鼠抗人IgG抗體。避光孵育20 min后，于外周血離心管內分別加入1×的紅細胞裂解液2 mL，震蕩混勻，避光孵育15 min。癌組織和癌旁組織則無需此過程。取2 mL PBS緩沖液重懸洗滌2次，離心，棄上清。采用流式細胞儀BD FACSCantoTMⅡ上機分析。

2 結果

2.1 OSCC組和對照組外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達OSCC組外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3表達水平[(4.02±0.68)%、(4.22±0.72)%]較對照組[(0.94±0.42)%、(1.24±0.65)%]高(t1=21.683，P1<0.001；t2=16.213，P2<0.001)。見圖1。

圖1 OSCC組和對照組外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達水平

2.2 癌組織與癌旁組織中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達OSCC癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3表達水平[(23.03±3.61)%、(24.33 ±3.83)%]較對照組[(10.84±2.03)%、(10.62±1.28)%]高(t1=14.656，P1<0.001；t2=16.624，P2<0.001)。見圖2。

圖2 OSCC患者癌組織和癌旁組織中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達水平

2.3 OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3表達與臨床病理指標的關系有淋巴結轉移的OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達水平高于無淋巴結轉移的患者(P<0.05)，OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達水平與年齡、性別、部位、腫瘤大小、病理學分級、TNM分期無關(P>0.05)。見表1、2。

表1 OSCC患者外周血中CD4+T淋巴細胞上TIM-3的表達與臨床病理特征的關系

表2 OSCC患者外周血中CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達與臨床病理特征的關系

2.4 OSCC患者癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達與臨床病理指標的關系TIM-3在OSCC患者癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上的表達水平與年齡、性別、部位、腫瘤大小、病理學分級、TNM分期、淋巴結轉移無關(P>0.05)。見表3、4。

表3 OSCC患者癌組織中CD4+T淋巴細胞上TIM-3的表達與臨床病理特征的關系

表4 OSCC癌組織中CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達與臨床病理特征的關系

3 討論

負性共刺激分子介導的T淋巴細胞功能障礙機制復雜，研究報道單純抗PD-1/PD-L1治療有效率低[4]。Shayan等[5]研究顯示，應用PD-1阻斷劑治療頭頸部腫瘤有效率<20%，這些提示僅阻斷PD-1/PD-L1并不能完全恢復T淋巴細胞功能，可能存在多種負調控途徑參與抗腫瘤免疫反應。TIM-3是除PD-1之外重要的T淋巴細胞耗竭標志，應用PD-1阻斷劑后TIM-3補償性上調，TIM-3的上調可抑制T淋巴細胞的免疫功能，雙重阻斷TIM-3和PD-1可以恢復耗竭性T淋巴細胞分泌細胞因子的能力，增強其抗腫瘤效應。TIM-3在CD4+T、CD8+T淋巴細胞上表達上調與各種腫瘤發生發展密切相關，但對TIM-3在OSCC患者CD4+T、CD8+T淋巴細胞上的表達相關研究較少。本研究采用流式細胞術檢測OSCC患者外周血、癌組織及癌旁組織中T淋巴細胞上TIM-3表達情況，探討其與OSCC臨床病理特征的關系，為OSCC的免疫靶向治療提供理論基礎。

T淋巴細胞參與適應性免疫應答在腫瘤發生發展中處于核心地位[5]。成熟的T淋巴細胞表面僅表達CD4+或CD8+[6]。CD4+輔助T淋巴細胞在適應性免疫反應的招募、激活和調節多個方面發揮著關鍵作用。CD8+T淋巴細胞應答的產生依賴于激活的CD4+T淋巴細胞的幫助。CD8+T淋巴細胞能特異性識別MHC-Ⅰ類分子呈遞內源性抗原，CD4+T淋巴細胞輔助CD8+T淋巴細胞參與腫瘤免疫反應，進而殺傷腫瘤細胞[7]。研究表明，相比于PD-1，TIM-3更能作為體內T淋巴細胞耗竭的標志物，PD-1-TIM-3+CD8+T淋巴細胞使T淋巴細胞增殖分泌能力降低，而PD-1+TIM-3-CD8+T淋巴細胞與T淋巴細胞功能無明顯相關性[8]。本研究發現，OSCC患者外周血CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3表達水平均高于對照組，與結腸癌、骨肉瘤及OSCC體內研究結果[9-11]一致，提示TIM-3在OSCC患者CD4+T、CD8+T淋巴細胞上高表達可能抑制下游信號通路及細胞因子的分泌，致使外周T淋巴細胞功能障礙，導致腫瘤的發生。

此外，本研究發現，OSCC患者癌組織CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3表達水平高于癌旁組織，與徐本玲等[12]研究結果一致，提示宿主與腫瘤之間的免疫反應極其復雜，腫瘤微環境中可能存在誘導其表達的因素，致使CD4+T、CD8+T淋巴細胞出現功能障礙，從而導致腫瘤微環境免疫抑制，促進腫瘤的發生發展。

本研究結果顯示，OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達水平與年齡、性別、部位、腫瘤大小、病理學分級、TNM分期無關，僅與有無淋巴結轉移相關，與以往的研究結果[10]一致，表明TIM-3在OSCC的發生發展中起負性調節作用，可能使T淋巴細胞出現功能障礙，耗竭性T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷能力減弱，從而促進腫瘤的發生與進一步轉移[13]。Cheng等[14]研究顯示胃癌癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達水平與淋巴結轉移、TNM分期等臨床病理特征相關，而本研究中OSCC癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3的表達水平與年齡、性別、部位、腫瘤大小、病理學分級、TNM分期、淋巴結轉移無關，可能是由于CD4+T、CD8+T淋巴細胞上TIM-3在不同腫瘤間表達存在差異。有研究證實，TIM-3、PD-1在多個腫瘤浸潤淋巴細胞及外周血T淋巴細胞上均存在高表達、共表達現象，且與疾病的發生發展有關[15-16]。因此，TIM-3、PD-1在OSCC患者中的表達水平可共同作為判斷OSCC患者預后的參考指標和治療靶點。

綜上所述，本研究結果支持TIM-3參與OSCC的免疫逃逸，TIM-3的過表達與OSCC的淋巴結轉移有關，可能與OSCC的預后有關。但由于未對患者術后進行長期隨訪，不能準確分析患者的預后，這也將是下一步研究的重點。