FQ-PCR法聯合咽拭子快速培養法在疑似肺炎支原體感染患兒診斷中的應用價值

張美華，徐清芳，黃凱達

(1.駐馬店市第一人民醫院 檢驗科，河南 駐馬店 463000；2.鄭州大學第一附屬醫院 檢驗科，河南 鄭州 450000)

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)為常見兒童呼吸道感染病原體，尤以兒童肺炎較為常見。調查顯示，社區兒童獲得性肺炎10%～30%由MP引發，但MP感染肺炎、其他病原菌感染肺炎臨床體征、癥狀等方面無特異性區別，故診斷難度較大，不利于臨床診療[1]。MP感染若未及時有效診治，隨病情進展，可引起肺外感染，尋求一種高效的早期診斷方法，對防治MP感染有積極意義。直接檢出病原體為MP診斷金標準，然而MP培養、分離條件高，生長緩慢，培養耗時長，故臨床應用明顯受限[2]。因此，尋求一種快速有效的檢測方法，早期明確有無MP感染，對指導臨床治療有重要價值。實時熒光定量聚合酶鏈反應(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)法、快速培養法為近年來興起的MP感染診斷方式，可快速測定咽拭子標本中MP-DNA，具有快速、不受病程影響等優勢，在MP所致肺炎鑒別中被廣泛應用[3]。但單一檢測準確度較低，易出現漏診、誤診現象，會延誤病情?；诖?，本研究探討FQ-PCR聯合咽拭子快速培養法在疑似MP感染患兒診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年4月至2020年3月就診于駐馬店市第一人民醫院的100例疑似MP感染患兒，男63例，女37例，年齡6個月～10歲，平均(5.14±2.23)歲，病程2～13 d，平均(7.46±2.61)d，<1歲23例，1～6歲41例，>6歲36例?；颊呒覍僦獣员狙芯?，簽署知情同意書。本研究經駐馬店市第一人民醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 選取標準(1)納入標準：①就診時存在不同程度發熱、咳嗽癥狀；②胸部X線顯示雙肺呈片狀陰影；③對大環內酯類抗生素效果好，對頭孢、青霉素等抗生素無效；④白細胞計數稍高或正常，血沉多增快。(2)排除標準：①入組前3 d接受大環內酯類藥物治療；②全身感染、藥物過敏史；③心、肝、腎功能不全；④免疫缺陷、血液系統疾病。

1.3 標本采集及檢測方法采集標本：就診當天，在無菌條件下由專業兒科護士取患兒咽拭子樣本，置于無菌生理鹽水，震蕩、密封，-20 ℃低溫保存待測。檢測方法：以FQ-PCR法、快速培養法測定MP，嚴格根據說明書操作，快速培養法試劑盒購自鄭州內瑞特生物技術公司，FQ-PCR法試劑盒購自廣州中山大學達安基因公司，儀器為實時熒光定量PCR擴增儀(杭州，博日line gene)。血清學檢測：取患兒2 mL靜脈血，離心，取上清液，采用間接熒光免疫法測定MP-IgM；單份血清MP-IgM陽性(雙份血清MP-IgM滴度增高>4倍)，滴度≥1∶80即可判定為MP感染。

1.4 聯合診斷標準陽性：FQ-PCR法、快速培養法診斷結果任一陽性。陰性：二者診斷結果均為陰性。

1.5 觀察指標(1)以血清學檢測為“金標準”，記錄FQ-PCR法、快速培養法及兩者聯合檢測結果。(2)比較快速培養法、FQ-PCR法及聯合檢測準確度、特異度、靈敏度、陰性預測值、陽性預測值。(3)分析MP-IgM陰性、陽性患兒MP-DNA拷貝數。

2 結果

2.1 檢測結果FQ-PCR法、快速培養法及兩者聯合檢測結果見表1。

表1 FQ-PCR法、快速培養法及兩者聯合檢測結果(n)

2.2 診斷效能聯合檢測特異度、陽性預測值與單一FQ-PCR法檢測和快速培養法檢測比較，差異無統計學意義(P>0.05)；聯合檢測靈敏度、準確度、陰性預測值高于單一FQ-PCR法檢測和快速培養法檢測(P<0.05)。見表2。

表2 FQ-PCR法、快速培養法及兩者聯合檢測診斷效能比較(%)

2.3 MP-DNA拷貝數MP-IgM陰性患兒MP-DNA拷貝數的對數值為(4.08±1.36)mL-1，陽性患兒拷貝數的對數值為(5.81±1.64)mL-1。陽性患兒MP-DNA拷貝數高于陰性患兒(t=5.554，P<0.001)。

3 討論

MP是一種機體常見的呼吸道感染病原體，可引發多系統損傷。相關研究指出，MP潛伏期也存在傳染性，且近年來呈局部流行趨勢，嚴重影響患兒生活質量[4]。細菌性、病毒性呼吸道感染僅根據臨床體征難以準確區分，且MP感染患兒對抗生素不敏感，故易延誤治療時間，增加肺外并發癥發生風險。早期快速有效的MP感染診斷方式對臨床治療至關重要。

血清學檢測為現階段MP感染主要診斷方式，準確率較高，對臨床鑒別MP感染、早期治療有重要指導價值，但MP-IgM常出現在感染后7 d，有一定的延后性，另外對于免疫缺陷患兒或免疫系統尚未發育完善的新生兒，血清學檢測具有明顯局限性[5]?？焖倥囵B法為近年來新興的MP直接檢測方法，培養液中含快速生長因子、高營養成分，樣本中僅有少量病原體就可實現快速繁殖，并于12～24 h得出結果，具有快速、簡單、敏感等優勢，但其特異度較低[6]。FQ-PCR法為體外擴增特異DNA片段新技術，逐漸被應用于早期MP感染檢測，可使極微量核酸片段于短時間內擴增到幾百萬個拷貝，具有快捷、簡便、靈敏度高、特異性強等特點[7]。相較于常規PCR，FQ-PCR法增加可識別擴增產物探針，同時輔以熒光標記，應用計算機掃描產物過程中熒光曲線，換算為DNA拷貝數，可準確定量目標，且操作方便，較短時間即可得到結果，能降低擴增產物污染風險，減少假陽性發生[8]。有研究指出，發病7 d內FQ-PCR法診斷特異度、敏感度可達90%以上，高于血清檢測，然而隨病程延長，血液檢查敏感度會逐漸升高，因此FQ-PCR法更適合早期快速診斷[9]。另有報道指出，FQ-PCR法、快速培養法在MP感染檢測中均有一定誤差，但二者檢測機制不同，聯合應用可起互補作用，能取長補短，互相佐證，提高診斷準確性[10]。本研究結果顯示，快速培養法聯合FQ-PCR法檢測靈敏度、準確度、陰性預測值較單一FQ-PCR法檢測及快速培養法檢測高，可見將咽拭子快速培養法、FQ-PCR法聯合應用于疑似MP感染患兒診斷中，可提高靈敏度、準確度、陰性預測值，有助于早期對癥治療，改善預后。

綜上，咽拭子快速培養法聯合FQ-PCR法在疑似MP感染患兒診斷中具有較高的靈敏度、準確度、陰性預測值，且熒光拷貝數越高對診斷MP感染越有利，可為臨床明確MP感染和早期治療提供依據。