GC法測定三香散中桂皮醛、反式茴香腦含量

陳驍勇 葛玉松 支榮榮▲

1.江蘇省鹽城市第一人民醫院藥劑科，江蘇鹽城 224000；2.江蘇省鹽城市食品藥品監督檢驗中心，江蘇鹽城 224000

三香散是鹽城市中醫院的自制制劑，由木香、小茴香、肉桂三味藥構成，具有溫中散寒、除脹止痛的功效，臨床上常用于小兒腸絞痛以及寒瀉而致腹脹、腹痛，為兒科腹痛腹脹的外用制劑[1-3]。目前，三香散標準為《江蘇省食品藥品監督管理局醫療機構制劑標準》JSZBZ20091017Z[4]，標準中只有顯微、理化鑒別等項目，缺乏定量測定的內容，其中肉桂、小茴香為三香散的主要成份[5-8]。本研究參照有關文獻[9-15]，建立氣相色譜法（GC）同時測定三香散中桂皮醛和反式茴香腦含量的方法，旨在為該醫院制劑三香散提供更好的標準和更新的依據，現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫7890A GC System 氣相色譜儀（Agilent Technologies），XS205 DU 電子天平（Mettler Toledo）；QLB型純凈空氣泵（山東塞克賽斯氫能源有限公司）；SPH-300 氫氣發生器（北京中惠普分析技術研究所）；A10 TOC monitor 實驗室純水（默克化工技術有限公司）

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 三香散（鹽城市中醫院自制制劑，規格：100 g，批號：191102、191120、191218）；肉桂、小茴香、木香均來自鹽城市第一人民醫院藥劑科；桂皮醛對照品（批號：110710-201619，含量：98.9%）、反式茴香腦對照品（批號：111835-201804，含量：99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2.2 試劑 超純水；乙酸乙酯為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-WAX 色譜柱（30 m×0.320 mm，0.25 μm）；柱程序升溫：初始110℃，保持2 min，5℃/min升溫至160℃，運行至12 min，30℃/min 升溫至220℃，保持5 min，50℃/min 降溫至110℃，保持2 min；進樣口溫度：250℃；FID 檢測器溫度：300℃；載氣：高純H2（體積分數>99.999%）；流速：30 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：10∶1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱定桂皮醛對照品、反式茴香腦對照品430.33 mg 和46.12 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯適量使容量瓶中對照品溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為43.033 mg/mL、4.612 mg/mL 的桂皮醛對照品儲備液和反式茴香腦對照品儲備液；精密量取上述桂皮醛對照品儲備液0.1 mL 與反式茴香腦對照品儲備液1.5 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.1721 mg/mL 和0.2767 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取三香散供試品，混合均勻，精密稱取0.5000 g，置于250 mL 具塞圓底燒瓶中，加入適量超純水與2 mL 乙酸乙酯，連接揮發油測定器，緩緩加熱至沸，并保持微沸約5 h，放冷至室溫，取上層乙酸乙酯液至5 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 有機微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照三香散處方中各飲片成分比例和該制劑的制備工藝，稱取0.2 g 木香、0.2 g 小茴香，制成不含肉桂的陰性樣品；稱取0.2 g 木香、0.1 g肉桂，制成不含小茴香的陰性樣品。按照“2.2.2”項下流程，制備不含有相應飲片的陰性樣品溶液，即缺小茴香的陰性樣品溶液，缺肉桂的陰性樣品溶液。

2.3 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下的桂皮醛對照品儲備液1 mL，置于20 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，分別取0.025、0.050、0.100、0.200、0.500 mL 置于25 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，用0.45 μm 有機微孔濾膜濾過，以1 μL 自動進樣至氣相色譜儀，測定各峰面積。以桂皮醛對照品濃度（X1）為橫坐標，桂皮醛對照品峰面積為縱坐標（Y1），繪制出標準曲線，得到桂皮醛的回歸方程為Y1=1948X1+36.908（R2=0.9995），桂皮醛在濃度0.00213～0.042 56 mg/mL 范圍中呈現良好的線性關系（圖1A）。

精密量取“2.2.1”項下反式茴香腦對照品儲備液0.4、0.8、1.0、1.5、5.0 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，同樣用0.45 μm 有機微孔濾膜濾過，以1 μL 自動進樣至氣相色譜儀，測定各峰面積。以反式茴香腦對照品濃度（X2）為橫坐標，反式茴香腦對照品峰面積為縱坐標（Y2），繪制出標準曲線，得到反式茴香腦的回歸方程為Y2=3425.3X2-62.95（R2=0.9996），反式茴香腦在濃度0.0734～0.9180 mg/mL范圍中呈現良好的線性關系（圖1B）。

圖1 標準曲線圖

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 按照“2.1”項下色譜條件，以1 μL自動進樣“2.2.1”項下制備的混合對照品溶液6次，至氣相色譜儀，記錄6次峰面積。計算得出，桂皮醛、反式茴香腦峰面積的RSD 分別為1.50%、0.84%，結果表明儀器精密度良好。

2.4.2 專屬性實驗 分別取“2.2”項下的供試品溶液、混合對照品溶液、缺小茴香陰性樣品溶液，缺肉桂陰性樣品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。結果顯示，主成分峰與雜質峰之間分離度達到要求，原輔料均無干擾（圖2）。

圖2 專屬性試驗氣相色譜圖

2.4.3 穩定性試驗 精密稱取三香散粉末（批號：191218）按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別置于室溫下0、1、2、4、8、12、24 h，按照“2.1”項的色譜條件自動進樣1 μL 于氣相色譜儀，分析測得桂皮醛、反式茴香腦的RSD值分別為1.44%、0.84%。結果表明，桂皮醛、反式茴香腦供試品溶液中，成分桂皮醛、反式茴香腦在室溫下24 h 內穩定。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取三香散粉末（批號：191218）按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項的色譜條件自動進樣1 μL 于氣相色譜儀進行進樣分析，得到桂皮醛、反式茴香腦的平均含量分別為0.1625、0.2473 mg/g，RSD值分別為0.96%、0.48%，結果表明，本實驗方法的重復性良好。

2.4.5 加樣回收率實驗 精密稱取三香散粉末（批號：191218）6份，分別加入質量濃度為0.1721 mg/mL 和0.2767 mg/mL 的混合對照品溶液1 mL，精密加入2 mL乙酸乙酯，加入適量超純水，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件自動進樣1 μL于氣相色譜儀進行進樣分析，計算回收率，結果見表1。結果顯示，兩種成分的平均回收率均＞9.9%，RSD≥1.50。

表1 加樣回收率實驗測試結果

2.4.6 樣品含量測定 取3個不同批號的三香散制劑（批號：191102、191120、191218），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別吸取3 批次供試品溶液各6次，按照“2.1” 項下色譜條件自動進樣1 μL 于氣相色譜儀進行進樣分析，記錄各峰面積，計算桂皮醛和反式茴香腦的含量，結果見表2。結果顯示，批號191120的三香散中，桂皮醛和反式茴香腦的含量均最高，分別為0.1611 mg（RSD=1.10%）和0.2555 mg（RSD=1.20%）。

表2 樣品含量測定（n=6）

3 討論

3.1 色譜柱選擇

分別選取Agilent DB-624 色譜柱（30 m×0.530 mm，3.00 μm）和Agilent DB-WAX 色譜柱（30 m×0.320 mm，0.25 μm），對樣品中的兩種化學成分進行分析。結果顯示，采用Agilent DB-WAX 色譜柱（30 m×0.320 mm，0.25 μm），兩種化學成分的分離度>1.5，理論塔板數較高，因此本研究選取Agilent DB-WAX 色譜柱。

3.2 成分提取

在成分提取過程中，采用超聲提取20 min 與水蒸氣蒸餾法1 h 進行對比，結果顯示，水蒸氣蒸餾法提取1 h，能將桂皮醛和反式茴香腦成分提取完全，并且操作簡便易行。本研究選取水蒸氣蒸餾法提取5 h，旨在使桂皮醛和反式茴香腦成分提取更加完全。

3.3 溫度選擇

由于三香散藥味多芳香，在分離各成分時發現，恒定柱溫無法有效分離各成分，經過比較沸點、初始溫度、升溫速率，末溫等因素，確定了程序升溫。結果顯示，初始110℃，保持2 min，5℃/min 升溫至160℃，運行至12 min，30℃/min 升溫至220℃，保持5 min，50℃/min 降溫至110℃，保持2 min，上述程序升溫方法能夠使低沸點組分和高沸點組分在色譜柱中有適宜地保留，各待測組分色譜峰分離度較好，且峰形比較對稱。

3.4 小結

本實驗采用了GC 測定三香散中桂皮醛、反式茴香腦的含量，方法學研究顯示，實驗中采取的方法能夠有效地對三香散中的桂皮醛和反式茴香腦進行含量測定，具有方便簡便、準確、省時、重復性好的特點，并且能夠彌補現有鑒定標準中對三香散各成分的定量鑒別內容的空白，為制劑充分發揮其治療小兒腹痛、腹脹、胃腸痙攣等癥狀的功效，提供理論依據。