lncRNA CASC9通過靶向miR-195-5p/CDK6軸調控肺鱗癌的進展

張星星,楊 磊,劉 芳,張 瑾,常麗花,馬運峰

(1西安交通大學基礎醫學院病原微生物與免疫學系,西安 710049;2西安醫學院第二附屬醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:mayunfeng@xjtu.edu.cn)

肺癌是造成世界范圍內癌癥相關死亡的主要原因之一。肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。其中,非小細胞肺癌是肺癌的主要亞型,約占肺癌總數的85%[1]。根據組織學特性的不同,非小細胞肺癌又可分為肺腺癌、肺鱗狀細胞癌(肺鱗癌)和大細胞癌[2]。據統計,約30%的非小細胞肺癌是肺鱗癌[3]。由于科研和醫療技術水平的提升,肺鱗癌的治療取得了很大的進步,但肺鱗癌患者的預后依然很差[4]。因此,尋找肺鱗癌相關的潛在生物標記物并研究其分子機制對肺鱗癌診斷具有重要意義,同時可開發針對生物標記物的靶向治療方法。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為RNA的類型之一,其長度超過200 nt,但不具備蛋白編碼能力[5]。近年來,由于lncRNA在不同類型的人類疾病中發揮重要的調節作用而被廣泛研究。研究發現lncRNA可通過調控基因的表達來影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程,進而影響腫瘤的進展[6-8]。盡管有報道稱lncRNA CASC9(癌癥易感性候選者9)與肺鱗癌的進展呈正相關[9],但其在肺鱗癌中的潛在分子機制還有待研究。

因此,本研究旨在揭示肺鱗癌中lncRNA CASC9的表達水平,并進一步探討其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胚腎細胞系293T、人正常肺細胞系BEAS-2B和肺鱗癌細胞系(SK-MES-1、NCI-H520、H1703和H2170)均購自ATCC細胞庫。lncRNA CASC9的干擾物(si-CASC9-1和si-CASC9-2)和陰性對照(NC),以及lncRNA CASC9的過表達質粒(CASC9)和陰性對照(NC)購自上海Gene Pharma公司。miR-195-5p mimics和陰性對照NC mimics,以及miR-195-5p inhibitor和陰性對照NC inhibitor購自廣州RiboBio公司。一抗(CDK6和GAPDH)和二抗購自美國CST公司。

1.2 細胞培養和轉染

所有細胞放置在充滿5% CO2的培養箱中,用含有10% FBS(HyClone, USA)、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養基(HyClone, USA)培養。細胞接種于6孔板中,待融合度達到80%時,根據試劑商提供的說明書用lipofectamine 3000(Invitrogen,USA)進行轉染,所有相關的轉染分組在后續實驗方法中根據實驗目的進行分組。轉染48 h后進行相關分析。

1.3 CCK8實驗檢測細胞增殖能力

為了研究CASC9對肺鱗癌細胞增殖能力的影響,首先將si-CASC9-1和si-CASC9-2轉染到SK-MES-1和H1703細胞以干擾CASC9的表達。每種細胞中分3組:NC、si-CASC9-1和si-CASC9-2。

為了探討CASC9和miR-195-5p是否通過CDK6影響癌細胞的增殖能力,用SK-MES-1和H1703細胞分別進行了如下2個實驗的共轉染:miR-195-5p與CDK6共轉染實驗中的分為NC inhibitor+si-NC組、NC inhibitor+si-CDK6組和miR-195-5p inhibitor+si-CDK6組;CASC9與CDK6共轉染實驗中分為NC+si-NC組、NC+si-CDK6組和CASC9+si-CDK6組。

根據以上不同的實驗和分組進行鋪板,肺鱗癌細胞以3 000/孔的數量接種在96孔板中,細胞轉染0,24,48,72 h每孔加入10 μl CCK8(Dojindo)工作液,置于細胞培養箱中繼續培養2 h,培養結束測定吸光度在450 nm處的吸光度值,細胞增殖能力根據CCK8試劑商提供的說明書計算。

1.4 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

利用Transwell實驗去研究干擾CASC9對細胞遷移和侵襲能力的影響。SK-MES-1和H1703細胞經過轉染后進行Transwell實驗,每種細胞的轉染分為NC組、si-CASC9-1組和si-CASC9-2組。轉染48 h后收集細胞并重懸,取200 μl用無血清培養基重懸的(5×104個細胞)細胞懸液加到Transwell小室的上室中(8 μm pore, Corning, USA),下室加600 μl含有10%FBS的DMEM培養基。48 h后用4%的多聚甲醛室溫固定15 min,以0.1%結晶紫染色15 min并用PBS沖洗干凈。細胞侵襲實驗中Transwell小室用基質膠(Corning, USA)進行包被,其余實驗步驟同細胞遷移實驗。在顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照并計數。

1.5 熒光素酶報告基因實驗驗證CASC9和miR-195-5p的潛在靶基因

為了驗證CASC9與靶基因miR-195-5p、以及miR-195-5p與靶基因CDK6之間的相互結合作用,我們構建了具有與miR-195-5p結合位點的CASC9或CDK6野生型和突變型報告質粒。將具有miR-195-5p結合位點的CASC9和CDK6的野生型序列與突變序列分別克隆到熒光素酶報告載體pmirGLO(Promega, China)中,得到CASC9野生型(CASC9-WT)、CASC9突變型(CASC9-MUT)、CDK6野生型(CDK6-WT)和CDK6突變型(CDK6-MUT)報告質粒。

CASC9和miR-195-5p熒光素酶實驗分為:CASC9-WT+NC mimics組、CASC9-WT+miR-195-5p mimics組、CASC9-MUT+NC mimics組和CASC9-MUT+miR-195-5p mimics組。CDK6和miR-195-5p熒光素酶實驗分為:CDK6-WT+NC mimics組、CDK6-WT+miR-195-5p mimics組、CDK6-MUT+NC mimics組和CDK6-MUT+miR-195-5p mimics組。根據以上分組將相應的物質轉染到人胚腎細胞系293T中。轉染48 h后收集細胞并裂解,利用熒光素酶檢測試劑盒(Promega)檢測熒光活性。

1.6 qRT-PCR實驗檢測CASC9、miR-195-5p和CDK6的表達

qRT-PCR實驗用來檢測肺正常細胞系(BEAS-2B)以及肺鱗癌細胞系(SK-MES-1、NCI-H520、H1703和H2170)中CASC9、miR-195-5p和CDK6的表達。

為了確認CASC9的干擾效率,將肺鱗癌細胞分別轉染NC、si-CASC9-1和si-CASC9-2,用qRT-PCR實驗檢測轉染后肺鱗癌細胞中CASC9的表達水平。

為了研究CASC9和miR-195-5p的表達是否具有相互調節作用,通過對肺鱗癌細胞中過表達miR-195-5p或干擾CASC9后,用qRT-PCR實驗檢測細胞中CASC9和miR-195-5p的表達。

根據以上不同實驗目的處理細胞,之后收集細胞并向細胞樣品中加入Trizol后超聲勻漿提取總的RNA并檢測RNA濃度。取1 μg RNA用逆轉錄試劑盒(TaKaRa)將RNA逆轉錄成cDNA。逆轉錄體系為:5×RNA逆轉錄酶2 μl;RNA 1 μg;DEPC水補到10 μl。反應程序為:42 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。之后通過SYBR Premix EX Taq試劑盒(TaKaRa)在熒光定量PCR儀中進行qRT-PCR反應。qRT-PCR反應體系為:2×Real time-PCR聚合酶10 μl;cDNA 0.5 μl;正向引物0.5 μl;反向引物0.5 μl,DEPC水補到20 μl。96孔板每孔加20 μl上述混合物后進行上機反應。反應程序為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s(40個循環)。GAPDH作為CASC9和CDK6的內參,U6作為miR-195-5p的內參。

1.7 Western blotting實驗檢測CDK6的蛋白表達水平

為了確定miR-195-5p和CASC9對CDK6蛋白表達的影響,將肺鱗癌細胞分別轉染NC mimics或miR-195-5p mimics、以及NC或CASC9。根據以上分組進行細胞轉染。收集不同處理組的肺鱗癌細胞并提取蛋白。用RIPA裂解液(碧云天,北京)重懸細胞后將細胞裂解,4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min,收集蛋白上清液,用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天,北京)檢測蛋白濃度,并將蛋白樣品煮沸變性。用10%的SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質,電泳結束后將SDS-PAGE膠上的蛋白轉移至PVDF膜。利用5%的脫脂奶粉將膜室溫封閉2 h,隨后將膜與一抗(CDK6,1 ∶1 000;GAPDH,1 ∶10 000)在4 ℃過夜敷育。TBST洗去未結合的一抗后使膜與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶2 000)室溫結合1 h。TBST洗3次,每次10 min。滴加ECL反應液(Thermo Fisher,USA)于膜上,室溫進行顯色反應,用Bio-Rad成像系統拍照。Image J軟件進行灰度分析并計算相關蛋白的表達水平。

1.8 生物信息學分析

為了研究CASC9、miR-195-5p和CDK6在LUSC中的表達,以及預測CASC9和miR-195-5p的靶基因,我們采用生物信息學進行了相關分析。

利用GEPIA數據庫分析了CASC9在癌組織和癌旁正常組織中的表達。在GEPIA數據庫中輸入“CASC9”并選擇肺鱗癌“LUSC”,則可獲得CASC9在癌組織和癌旁正常組織中表達的箱線圖。

CASC9在肺腺癌患者不同階段的表達利用Lnc2Cancer 3.0數據庫完成,通過在Lnc2Cancer 3.0數據庫中輸入“CASC9”并選擇肺鱗癌“LUSC”則可獲得CASC9在肺腺癌患者不同階段的表達。

利用lncbase和starbase數據庫預測CASC9潛在的下游靶基因miRNAs。

通過在pubmed中搜索癌癥與CASC9的4個靶基因相關的文獻,發現miR-195-5p可作為腫瘤抑制因子,因此選擇miR-195-5p作為CASC9的靶基因進行研究。

利用miR-pathway數據庫分析miR-195-5p在包括肺腺癌等多種癌癥中的表達。

miR-195-5p的靶基因由miRDB、miRWalk、TargetScan、starbase和miRTarbase數據庫預測。

miR-195-5p的靶基因由京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數據庫進行了通路富集分析。

利用GEPIA和UALCAN數據庫分析CDK6在癌組織和癌旁正常組織中的表達。

1.9 統計學分析

本研究中所有數據均利用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。所有數據以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗,多組間的比較采用單因素單方差分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA CASC9在肺鱗癌中高表達

我們首先通過GEPIA數據庫分析了CASC9在癌組織和癌旁正常組織中的表達,結果表明與癌旁正常組織相比,肺鱗癌癌組織中CASC9的表達明顯升高(見圖1A)。通過lnc2cancer數據庫進一步分析發現CASC9的表達與肺鱗癌患者的腫瘤分期呈正相關(見圖1B)。此外,我們利用qRT-PCR檢測了人正常肺細胞和肺鱗癌細胞系中CASC9的表達量,結果表明CASC9在癌細胞的表達高于正常細胞(見圖1C)。以上結果表明CASC9在肺鱗癌中高表達,可能與肺鱗癌的進展相關。

圖1 CASC9在肺鱗癌癌組織和細胞中高表達Figure 1 CASC9 is high expressed in lung squamous cell carcinoma tissues and cells

2.2 干擾CASC9對肺鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

qRT-PCR實驗檢測結果發現,肺鱗癌細胞中CASC9的表達在轉染了si-CASC9后明顯降低(見圖2)。

與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 CASC9的干擾效率Figure 2 The interference efficiency of CASC9

CCK8實驗分析發現,肺鱗癌細胞中干擾CASC9后,細胞增殖能力顯著降低(見圖3)。

Transwell實驗表明干擾CASC9后肺鱗癌細胞的遷移和侵襲能力受到顯著的抑制(見圖4)。

2.3 CASC9直接靶向miR-195-5p并調控其表達

為了研究CASC9促進肺鱗癌進展的分子機制,我們利用lncbase和starbase數據庫預測CASC9潛在的下游靶基因miRNAs,在2個數據庫中發現4個共同存在的潛在靶基因:miR-424-5p,miR-15a-5p,miR-195-5p,miR-15b-5p(見圖5A)。通過對4個miRNAs在癌癥中作用的檢索發現miR-195-5p在多種癌癥中發揮腫瘤抑制因子的作用,因此選擇miR-195-5p作為CASC9的潛在靶基因來進一步研究。圖5B為CASC9和miR-195-5p的潛在結合位點以及結合位點的突變序列。同時,利用miR-pathway數據庫分析發現,miR-195-5p在NSCLS的兩個重要亞型肺鱗癌和肺腺癌中的表達明顯低于正常對照(見圖5C)。

與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖3 CASC9對肺鱗癌細胞增殖的影響Figure 3 The effect of CASC9 on the proliferation of LUAD cells

與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖4 干擾CASC9對肺鱗癌細胞遷移和侵襲的影響Figure 4 The effect of CASC9 knockdown on the migration and invasion of LUAD cells

圖5 CASC9靶向miR-195-5pFigure 5 CASC9 targets miR-195-5p

我們通過qRT-PCR進一步發現在肺鱗癌細胞系中miR-195-5p呈低表達(見圖6A),表明miR-195-5p可能發揮抑制肺鱗癌的作用。為了證實CASC9與miR-195-5p之間的靶向關系,我們將具有與miR-195-5p結合位點以及結合位點突變的CASC9報告質粒(WT和MUT)與miR-195-5p mimics進行共轉染,結果發現WT報告質粒處理組中熒光素酶活性顯著低于MUT組(見圖6B),表明CASC9可直接靶向miR-195-5p。通過對肺鱗癌細胞分別轉染miR-195-5p mimics和si-CASC9,并利用qRT-PCR分析發現miR-195-5p和CASC9呈負向調控關系(見圖6C,D)。因此,上述結果表明肺鱗癌中CASC9可直接靶向miR-195-5p并負調控其表達。

圖6 CASC9靶向并調控miR-195-5p的表達Figure 6 CASC9 targets and regulates the expression of miR-195-5p

2.4 miR-195-5p靶向CDK6

我們通過miRDB、miRWalk、TargetScan、starbase和miRTarbase數據庫預測了miR-195-5p的潛在靶基因,發現23個靶基因共同出現在5個數據庫中(見圖7A)。我們將此23個靶基因進行KEGG通路富集分析,發現CDK6與非小細胞肺癌相關(見圖7B)。通過對GEPIA和UALCAN數據庫的分析發現,CDK6在肺鱗癌癌組織中明顯高表達(見圖7C,D)。此外,熒光素酶報告基因實驗表明miR-195-5p mimics可明顯降低CDK6-WT組細胞的熒光活性(見圖7E)。

圖7 miR-195-5p靶向CDK6Figure 7 miR-195-5p targets CDK6

2.5 CASC9/miR-195-5p調控CDK6的表達

qRT-PCR結果表明CDK6在肺鱗癌細胞中的表達高于正常細胞(見圖8A)。隨后,Western blotting結果發現過表達miR-195-5p后CDK6的表達顯著被抑制(見圖8B)。而肺鱗癌細胞中轉染CASC9過表達質粒和陰性對照NC后,結果表明過表達CASC9可明顯促進CDK6的表達(見圖8C)。

圖8 CASC9/miR-195-5p調控CDK6的表達Figure 8 CASC9/miR-195-5p regulates the expression of CDK6

2.6 CASC9/miR-195-5p調控CDK6介導的細胞增殖

CCK-8結果發現干擾CDK6后細胞增殖能力明顯減弱(見圖9)。而營救實驗表明,將miR-195-5p inhibitor或CASC9過表達質粒與si-CDK6共轉染到肺鱗癌細胞后,敲低CDK6對細胞增殖能力的抑制作用顯著被逆轉(見圖9)。這些結果表明CASC9/miR-195-5p通過介導CDK6調控癌細胞的增殖,從而促進肺鱗癌的進展。

圖9 CASC9/miR-195-5p調控CDK6介導的細胞增殖Figure 9 CASC9/miR-195-5p regulates CDK6-mediated cell proliferation

3 討論

肺鱗癌作為常見的人類惡性腫瘤之一,目前對于其發病機制還未完全闡明。因此,有待進一步研究其內在致病相關的分子機制。據報道,lncRNA CASC9在多種癌癥中通過發揮促癌基因的作用促進腫瘤的進展。例如,CASC9在結直腸癌中異常高表達,CASC9的高表達與患者的不良預后呈正相關,并且CASC9通過CPSF3-TGFβ2信號途徑調控癌癥的進展[10]。此外,最近的研究表明CASC9在膀胱癌中的表達顯著上調,且與組織學分級、TNM分期和患者預后有關,沉默CASC9可抑制腫瘤的生長和膀胱癌的轉移;而在分子機制上,CASC9通過正向調控FZD6的表達并激活Wnt/β-catenin信號傳導途徑,從而發揮促進膀胱癌的作用[11]。在本研究中,我們通過生物信息學分析和實驗檢測發現CASC9在肺鱗癌癌組織和細胞系中的表達顯著上調,表明CASC9可能發揮促進肺鱗癌進展的作用。因此我們通過干擾CASC9來研究其對肺鱗癌細胞表型的影響。結果表明干擾CASC9可明顯抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

lncRNA調控腫瘤進展的一種重要模式是通過充當競爭性內源性RNA(ceRNA)[12]。例如,LINC01133通過靶向miR-106a-3p調控APC表達和Wnt/β-catenin信號途徑來抑制胃癌的進展[13]。在卵巢癌中,lncRNA PTAR可通過競爭性結合miR-101-3p上調ZEB1的表達,進而加速卵巢癌的EMT過程和轉移的發生[14]。此外,lncRNA CDC6通過吸附microRNA-215而介導乳腺癌中CDC6的表達,因此促進乳腺癌的進展[15]。lnc00511在肺鱗癌中表達的升高與腫瘤分期相關,且通過抑制miR-150-5p和激活TADA1促進肺鱗癌的增殖和遷移[16]。為了研究CASC9在肺鱗癌中的作用機制,我們通過生物信息學的分析和熒光素酶報告基因實驗發現miR-195-5p可作為CASC9的靶基因,其表達在肺鱗癌癌組織和細胞系中均降低,說明miR-195-5p在肺鱗癌中可能發揮抑癌的作用。同時,miR-195-5p與CASC9的表達呈負向調控關系。在本研究中,我們同樣探討了CASC9是否通過ceRNA的模式影響癌細胞的表型。我們首先通過生物信息學軟件分析發現CDK6可能是miR-195-5p的潛在下游靶基因。已有研究發現CDK6在膀胱癌、結腸癌和卵巢癌[17-19]等多種癌癥中高表達。我們進一步通過熒光素酶報告基因實驗證明miR-195-5p可直接靶向CDK6。本研究發現,作為促癌基因,CDK6在肺鱗癌組織和細胞中的表達均升高。此外,我們發現過表達miR-195-5p可抑制CDK6的表達,而過表達CASC9可明顯上調CDK6的表達。結合干擾CASC9后miR-195-5p表達升高的結果,本研究說明CASC9以ceRNA的模式影響了肺鱗癌的進展,即CASC9通過靶向miR-195-5p/CDK6信號軸調控肺鱗癌的進展。

總之,我們的研究表明CASC9在肺鱗癌中呈高表達,且CASC9的表達與肺鱗癌患者的腫瘤分級呈正相關。分子機制研究表明CASC9通過靶向抑制miR-195-5p上調癌基因CDK6的表達。因此,本研究結果表明CASC9/miR-195-5p/CDK6信號通路可能是肺鱗癌診斷或治療的潛在分子靶點。