艾司西酞普蘭聯合有氧運動對小鼠抑郁癥的治療作用

孫一鳴,谷昱琛,黃瑩瑩,梁 心,魯 明,劉 哲*

(1蚌埠醫學院第一附屬醫院藥劑科,蚌埠 233000;2蚌埠醫學院藥學院藥理教研室;3南京醫科大學基礎醫學院藥理教研室;*通訊作者,E-mail:liuzhe@bbmc.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:lumingnjmu@sina.com)

抑郁癥(major depressive disorder,MDD)是最常見的精神疾病,全球約3.5億患者,已然成為了嚴重的公共衛生問題[1]。據WHO調查結果顯示,自2004年起抑郁癥已成為人類第三大頑癥,預計至2030年抑郁癥將成為影響人類生活的第一大精神疾病,僅中國抑郁癥患者就有9 000萬,終生患病率6.1%-9.5%,這個數字還在逐年增長,給家庭和社會帶來嚴重的傷害及經濟負擔[2,3]。

已有研究表明,抑郁癥是一類以星形膠質細胞丟失及功能異常為主要病理特征,并伴隨神經炎癥的神經精神類疾病[4,5]。抑郁癥尸檢結果顯示,與正常人相比,抑郁癥患者皮層、海馬體積萎縮,多個腦區的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素以及前列腺素(PGE2)等致炎因子水平明顯增加[6]。抑郁癥發病機制假說包括單胺類神經遞質假說、神經營養因子假說、神經內分泌假說、免疫炎癥假說[7,8],目前臨床治療主要基于單胺類神經遞質假說,一線治療藥物選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)可誘導血清素轉運體(serotonin transporter,SERT)內化,從而增加細胞間隙(Serogtonin,5-HT)濃度,達到緩解抑郁樣癥狀的目的,但此類藥物對三分之一的抑郁癥患者效果較差[9]。臨床治療方案常建議患者聯合有規律的有氧運動,可有效改善患者抑郁樣癥狀,但是其治療機制尚不明確[10]。本研究擬建立慢性溫和不可預知應激模型(chronic mild stress,CMS),探究艾司西酞普蘭與有氧運動結合對抑郁癥小鼠星形膠質細胞丟失、促炎因子含量及氨基酸水平的調節作用,并探索艾司西酞普蘭聯合有氧運動對抑郁癥發生發展的影響,為抗抑郁藥物研發和臨床治療提供新的思路及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

1.2 慢性溫和不可預知應激抑郁模型的建立

采用3月齡雄性C57BL/6小鼠,適應實驗環境2 d,適應糖水2 d,剔除不合格小鼠。隨機分為空白對照組(Control,CON,n=7)、慢性溫和不可預知溫和應激模型組(chronic mild stress,CMS,n=7)、艾司西酞普蘭組(ESCIT,n=7)、聯合治療組(艾司西酞普蘭+轉籠有氧運動2 h,ESCIT+AE,n=7)。連續CMS應激6周后進行相關行為學檢測小鼠建模成功與否。從第7周開始艾司西酞普蘭組給予腹腔注射ESCIT(5 mg/kg)、聯合治療組給予ESCIT(5 mg/kg)+AE 2 h治療至第10周,隨后再次檢測小鼠抑郁樣行為,每周均采用糖水偏好實驗檢測小鼠糖水偏好率。實驗小鼠均單籠飼養,給予充足的飲用水及飼料(除非模型需求)。CON組小鼠正常給予進食、飲水,與模型組分開放置,避免任何可能的刺激。CMS抑郁模型[11]實驗小鼠每天隨機給予2-3種應激源,刺激10周,每天給予的應激源及應激時間不可雷同。CMS模型應激源如下:夾尾巴(3 min)、不定時噪音、晝夜顛倒(24 h)、冰水浴(2-3 min)、50 ml束縛管束縛(4-6 h)、濕籠(8 h)、45°斜籠(12 h)、禁水(12 h)、禁食(12 h)、閃燈(12 h)等。轉籠有氧訓練:采用寵物鼠轉籠,直徑8 cm,底座用固定架固定,轉籠有氧運動30 min/次,4次/d。CON組和CMS組小鼠不做任何訓練,自由活動。

1.3 行為學實驗檢測小鼠抑郁樣行為

1.3.1 糖水偏好實驗 小鼠籠內放置蒸餾水和1%蔗糖溶液各1管,觀察8 h內各組小鼠對兩種液體的飲用情況,在第4小時交換蒸餾水與糖水的位置,防止位置偏好,檢測8 h后稱量兩管液體的質量。計算糖水消耗比例:蔗糖水消耗比例=蔗糖水消耗(g)/(蔗糖水消耗+純水消耗)×100%。每周均采用糖水偏好實驗(sucrose preference test,SPT)檢測小鼠糖水偏好率。

1.3.2 強迫游泳實驗 采用強迫游泳實驗(forced swimming test,FST)評價小鼠抑郁樣行為。具體操作為將燒杯(高30 cm,直徑20 cm)中注入蒸餾水約4 L,水溫為25 ℃。記錄燒杯中小鼠的游泳狀態,從將小鼠置于燒杯內開始記錄,記錄6 min的游泳行為,并統計最后4 min小鼠的不動時間。在第6周和第10周各進行一次強迫游泳實驗,不動時間越短,抗抑郁作用越強。

1.3.3 懸尾實驗 采用懸尾實驗(tail suspension test,TST)評價小鼠抑郁樣行為。將小鼠尾巴后三分之一固定于支架上,保持小鼠頭部懸掛向下(距離臺面15 cm)。記錄小鼠6 min行為變化,統計實驗小鼠后4 min的不動時間。在第6周和第10周各進行一次懸尾實驗,不動時間越短,抗抑郁作用越強。

1.3.4 曠場實驗 采用曠場實驗(opening field test,OFT)評價小鼠抑郁樣行為。將小鼠放置于箱內底面中心,計時6 min。通過計算給定時間內小鼠行走軌跡路線及去到活動中心的次數,評價實驗小鼠在曠場環境中的自主探索行為與焦慮行為。在第6周和第10周各進行一次曠場實驗,自主運動路線越長,抗抑郁及焦慮作用越強。

1.4 ELISA酶聯反應檢測小鼠外周血炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的含量

行為學檢測完畢,每組7只實驗小鼠分別眼球取外周血800 μl,4 ℃ 3 000g離心10 min,取外周血上清放入新的EP管,凍存于-80 ℃,備用。將樣品與標準品稀釋后分別加入相應的96孔板中,再加入生物素化抗體,37 ℃放置30 min,洗板5次。加入酶結合物工作液,37 ℃孵育30 min,洗板5次。每孔都加入顯色液A液B液,各50 μl,37 ℃避光孵育15 min。加入終止液50 μl終止反應,450 nm波長處測量吸光度,根據吸光度算出標準曲線,再計算檢測樣品的濃度。

1.5 HPLC-ECD法檢測小鼠海馬組織氨基酸類遞質的含量

采用HPLC-ECD法檢測小鼠海馬組織勻漿的氨基酸類遞質含量。實驗小鼠眼球取血后,每組取3只小鼠立即處死,迅速剝離大腦置于冰盒上并分離海馬組織,放入EP管去皮稱重,其中左側海馬組織按10 μl/mg組織加入勻漿液(0.1 mol/L高氯酸,0.1 mmol/L EDTA.2Na,DHBA 3.5×10-8mol/L),超聲勻漿。4 ℃,20 000 r/min離心30 min,取上清定量分裝后置于-70 ℃冰箱,備用。系統組成及參數設置如下:HPLC-ECD檢測系統(Thermo Fisher Scientific,USA),Thermo UniMate 3000 Pump;流速0.2 ml/min;UniMate 3000 Autosampler,4 ℃,進樣10 μl;ESA Coulochem Ⅲ Electrochemical Detector,5041檢測池電壓350 mV,Guard Cell電壓360 mV,Rang 100 nA,Filter 5S;DIONEX Acclaim Rapid Separation Liquid Chromatography(RSLC) C18 2.2 μm,2.1 mm×100 mm;柱溫38 ℃;Chromeleon 6.9色譜工作站采集與分析數據。流動相組成及配比:NaH2PO490 mmol/L、檸檬酸50 mmol/L、OSA 1.7 mmol/L、EDTA 50 μmol/L、乙腈5%。

1.6 免疫熒光檢測小鼠海馬腦區星形膠質細胞表達

采用免疫熒光染色檢測小鼠海馬腦區星形膠質細胞的陽性數。實驗小鼠眼球取血后,每組取4只小鼠給予腹腔注射戊巴比妥鈉(1%,45 mg/kg),麻醉效果滿意后,自左心室灌注PBS,沒有血色后,繼續灌注4%多聚甲醛,直至小鼠四肢僵直。即刻取出全腦放入5 ml EP管4%多聚甲醛固定、過夜。20%和30%蔗糖溶液連續梯度脫水5-7 d。以OCT膠包埋,切片,每片30 μm,裝入甘油 ∶PBS為1 ∶1的混勻液中,-20 ℃保存。挑出典型海馬區的腦片,PBS漂洗3次,每次10 min,用含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS配制的5% BSA封閉腦片1 h,棄去封閉液,不用清洗腦片,直接加入小鼠源性anti-GFAP,由抗體稀釋液配成,4 ℃過夜。復溫1 h,PBS漂洗3次,每次5 min,加入PBS配制的紅色熒光小鼠二抗,室溫孵育1 h。PBS漂洗3次,每次5 min,采用含防淬滅劑的DAPI進行染核,封片。體視學顯微鏡(Axiovert LSM510,Carl Zeiss Co)下觀察拍片計數。

1.7 體視學細胞計數檢測小鼠海馬腦區星形膠質細胞陽性數

免疫熒光陽性細胞計數采用體視學立體計數法(Stereo Investigator software,Microbrightfield,Williston,VT,USA)。根據小鼠腦圖譜,在20倍的物鏡下找到海馬區并圈出海馬區的目的區域,計數框為100 μm×100 μm。目的區域以外的陽性細胞不列入計數范圍,采用Stereo Investigator 7.0軟件統計分析計算陽性細胞總數。

1.8 免疫印跡(Western blotting,WB)檢測小鼠海馬腦區焦亡相關蛋白表達

右側海馬組織稱重,按比例加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,組織勻漿,16 000 r/min×15 min,4 ℃離心,吸取上清。取1 μl進行BCA蛋白定量(碧云天,上海),余下上清蛋白按照體積比加入1/4體積的5×Loading buffer,95 ℃金屬浴,5 min,分裝-20 ℃保存備用。上樣后,300 mA恒流下電轉,轉至PVDF膜(Millipore,USA)。在10%脫脂奶粉里封閉1 h,結束后TBST漂洗3次,每次10 min,再加入TBST配制5% BSA的一抗,4 ℃孵育過夜。所用的一抗包括:鼠抗GFAP(1 ∶1 000),兔抗GSDMD(1 ∶1 000),鼠抗Caspase-1(1 ∶1 000),小鼠抗GAPDH(1 ∶1 000)。復溫30 min,TBST漂洗10 min×3次。加入HRP標記的二抗:山羊抗小鼠-HRP(1 ∶2 000),室溫孵育1 h,TBST漂洗10 min×3次,用Image Quant LAS 4000(GE)化學發光成像系統顯色。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 ESCIT聯合AE改善CMS小鼠抑郁樣行為

與對照組相比,模型組小鼠糖水偏好率降低(P<0.01);與模型組相比,艾司西酞普蘭組及聯合治療組小鼠糖水偏好率增加(P<0.05);與艾司西酞普蘭組相比,聯合治療組小鼠糖水偏好率顯示增加趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05,見圖1)。與對照組相比,模型組小鼠TST不動時間、FST不動時間增加,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組相比,艾司西酞普蘭組及聯合治療組小鼠TST不動時間、FST不動時間減少,差異有統計學意義(P<0.05);與艾司西酞普蘭組相比,聯合治療組小鼠TST不動時間、FST不動時間有減少趨勢,差異無統計學意義(P>0.05,見圖1)。與對照組相比,模型組小鼠曠場總運動路線減少(P<0.01);與模型組相比,艾司西酞普蘭組及聯合治療組小鼠曠場總運動路線增加(P<0.05);與艾司西酞普蘭組相比,聯合治療組小鼠曠場總運動路線增加,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

與空白對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01;與艾司西酞普蘭組相比,△P<0.05圖1 艾司西酞普蘭聯合有氧運動改善CMS小鼠抑郁樣行為Figure 1 ESCIT combined with AE improves depression-like behavior in CMS mice

2.2 ESCIT聯合AE可降低CMS小鼠外周血促炎因子水平

ELISA結果表明,與對照組相比,模型組外周血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度增加(P<0.01);與模型組相比,艾司西酞普蘭組及聯合治療組外周血清促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度降低(P<0.05);與艾司西酞普蘭組相比,聯合治療組外周血清促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度有降低趨勢,差異無統計學意義(P>0.05,見圖2)。四組間外周血清抑炎因子IL-10差異無統計學意義(P>0.05,見圖2)。

與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01圖2 艾司西酞普蘭聯合有氧運動降低CMS小鼠外周血促炎因子水平Figure 2 ESCIT combined with AE inhibits inflammatory factors in peripheral blood of CMS mice

2.3 ESCIT聯合AE緩解CMS小鼠海馬腦區星形膠質細胞焦亡

免疫熒光結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠海馬腦區星形膠質細胞GFAP陽性細胞顯著減少,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組相比,艾司西酞普蘭組及聯合治療組小鼠海馬腦區星形膠質細胞GFAP陽性細胞增加(P<0.05);與艾司西酞普蘭組相比,聯合治療組小鼠海馬區星形膠質細胞GFAP陽性細胞略有增加,但差異無統計學意義(P>0.05,見圖3)。此外Western blotting結果顯示,CMS小鼠海馬腦區GSDMD,Caspase-1成熟體表達顯著增加,ESCIT聯合AE可改善CMS小鼠海馬區GSDMD,Caspase-1成熟體表達水平(見圖3)。

圖3 艾司西酞普蘭聯合有氧運動緩解CMS小鼠海馬腦區星形膠質細胞丟失Figure 3 ESCIT combined with AE increases the amount of astrocytes in the hippocampus of CMS mice

2.4 ESCIT聯合AE改善CMS小鼠海馬組織?；撬峒唉?氨基丁酸水平

HPLC檢測結果表明,與對照組相比,模型組小鼠海馬腦區?；撬?、γ-氨基丁酸含量增加,差異有統計學意義(P<0.001);與模型組相比,艾司西酞普蘭組及聯合治療組小鼠?；撬?、γ-氨基丁酸水平降低,差異有統計學意義(P<0.01);與艾司西酞普蘭組相比,聯合治療組小鼠海馬腦區?；撬?、γ-氨基丁酸水平略降低,差異無統計學意義(P>0.05,見圖4)。

與對照組組相比,***P<0.001;與模型組相比,###P<0.05圖4 艾司西酞普蘭聯合有氧運動改善CMS小鼠海馬組織?；撬峒唉?氨基丁酸水平Figure 4 ESCIT combined with AE improves Tau and GABA levels in hippocampus of CMS mice

3 討論

與正常人相比,抑郁癥患者尸檢結果顯示額葉皮層、海馬體積及質量顯著減少,星形膠質細胞數量減少,其標記物GFAP和S100鈣結合蛋白β(S100β)的mRNA水平和蛋白表達亦顯著下調[12],其他神經系統疾病則是以神經元的異常為主。同時抑郁癥患者多個腦區出現廣泛的神經炎癥反應,白介素(interleukin,IL)家族成員(IL-1,IL-6)、TNF-α和PGE2等致炎因子水平顯著升高[13,14]。因此,抑郁癥是一類以星形膠質細胞病理改變及功能障礙為主要特征,伴隨神經炎癥的神經精神類疾病。尋找理想的干預靶標,抑制星形膠質細胞丟失并恢復其正常功能,抑制炎癥過度激活有望成為抑郁癥治療和藥物研發的新方向和新策略。

基礎研究也顯示當機體受到外界過度刺激時,外周免疫細胞、單核細胞會過度釋放炎癥因子,而在炎性環境下血腦屏障的通透性顯著增加,外周炎癥因子則會透過血腦屏障進入腦內,促使腦內產生過度的炎性反應[15]。此外,外周炎癥因子、趨化因子以及色氨酸代謝產物也會激活腦內膠質細胞,加劇神經炎性反應。炎癥因子對單胺類神經遞質代謝、谷氨酸代謝及神經毒性、突觸可塑性、下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic pituitary adrenal axis,HPA)的興奮性均產生影響[16,17]。因此,試圖通過抑制神經炎癥的過度激活改善抑郁癥狀有一定理論基礎。細胞焦亡(pyroptosis)是近年發現并被證實由Gasdermin家族蛋白介導的調節性細胞死亡形式,也是一種炎性細胞死亡形式。不同的蛋白酶或者顆粒酶介導了Gasdermin家族蛋白的剪切,使其釋放N末端結構域,隨后轉運到細胞膜上形成焦亡小孔,由此引起細胞膜通透性改變、細胞腫脹和細胞膜破裂,釋放胞內炎性物質[18,19],介導焦亡的發生發展。

世界衛生組織調查結果顯示,抑郁癥女性患者平均發病率遠高于男性平均發病率,且女性抑郁癥主要發生在圍絕經期和月經周期的低雌激素階段,目前各個醫學領域也普遍認為雌激素與抑郁癥密切相關,因此本研究為避免雌激素干擾實驗結果,選用雄性小鼠建立CMS模型[20,21]。本研究結果表明,模型組曠場總路線相較于對照組顯著縮短,給予艾司西酞普蘭及有氧運動治療至第10周,曠場總路線顯著增多,說明艾司西酞普蘭聯合有氧運動可顯著改善模型組小鼠焦慮抑郁樣行為。與對照組相比,模型組小鼠促炎因子水平顯著升高,海馬腦區星形膠質細胞顯著丟失,焦亡相關蛋白表達水平增加,給予艾司西酞普蘭及有氧運動治療至第10周,顯著改善模型組小鼠促炎因子水平、焦亡相關蛋白表達。提示模型組小鼠外周血促炎因子水平增加以及海馬腦區星形膠質細胞的丟失可能與星形膠質細胞焦亡相關,給予艾司西酞普蘭及有氧運動治療后緩解模型組小鼠外周炎癥因子水平及海馬腦區細胞焦亡。其中,艾司西酞普蘭聯合有氧運動治療組與艾司西酞普蘭單用組相比,TST、FST不動時間減少,外周血促炎因子降低,海馬腦區GFAP表達增加、焦亡相關蛋白表達減少,但結果無統計學差異,分析其原因一可能與樣本量較少有關,原因二可能與聯合治療組小鼠運動時間略短有關。?；撬崾且活惡虬被?可維持內環境穩態,具有神經營養和神經保護作用,可促進大腦發育,增強記憶[22,23]。本研究表明,模型組小鼠海馬腦區?；撬崴斤@著增加,可能是應激作用下機體的代償作用。在哺乳動物的中樞神經系統中γ-氨基丁酸是一種天然存在的非蛋白質氨基酸,也是一種抑制性的神經遞質,具有鎮靜、抗焦慮、增強記憶以及改善睡眠的作用,對抑郁、失眠、自主神經失調等疾病均具有保護作用[24,25]。本研究中模型組小鼠海馬腦區γ-氨基丁酸水平顯著降低,小鼠抑郁樣癥狀增加,也與報道相符,給予艾司西酞普蘭及有氧運動治療后,上述變化顯著改善。艾司西酞普蘭結合有氧運動可能通過調節?；撬峒唉?氨基丁酸水平,減少神經毒性,促進神經再生,從而通過神經保護發揮抗抑郁作用,其機制需進一步探究。

綜上所述,艾司西酞普蘭聯合有氧運動對抑郁小鼠焦慮行為的治療效果優于艾司西酞普蘭單獨治療組,其機制可能是通過抑制外周促炎因子水平及星形膠質細胞焦亡,調節體內氨基酸水平緩解神經炎癥,該研究進一步充實了神經炎癥假說,為下一步臨床治療提供基礎實驗依據。