苦參素對晚期糖基化產物誘導的人血管平滑肌細胞表型轉化的抑制作用及其機制

岳向明,王軍奎,王巧娥,劉仲偉,邢玉潔,晁 娜*

(1陜西中醫藥大學第二臨床醫學系內科教研室,西安 712046;2陜西省人民醫院心血管內科;3延安大學醫學院內科學系;*通訊作者,E-mail:tyyqga@sina.com)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)大血管并發癥的特征性病理改變是動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS),同時DM作為一個獨立危險因素,能夠加速AS發生發展的進程,但分子機制尚不明確。晚期糖基化產物(advanced glycation end products, AGEs)具有典型的代表性,是DM患者體內特征性的病理性代謝產物,其水平與主要心血管事件(MACE)的發生密切相關[1]。

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)表型轉化在AS發生發展的各個階段均扮演重要的角色,合成型的VSMCs分泌細胞外基質(extra cellular matrix, ECM)以及各種炎性細胞因子,參與AS斑塊的形成及進展[2]。課題組前期研究表明VSMCs內Notch信號通路激活是AGEs誘導VSMCs發生表型轉化的重要分子機制[3]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)下游的重要通路蛋白激酶RNA樣內質網激酶(protein kinase RNA-like ER kinase, PERK)信號通路與諸如凋亡、自噬以及纖維化等多種病理生理學反應有關[4]。一項研究結果顯示,PERK信號通路的激活導致細胞表面Dll4的表達增多[5]。此外,多項體內及體外研究也證實了AGEs可誘發ERS的激活[6,7]。因此,我們推測PERK信號通路是ERS與Notch信號通路之間交互作用的橋梁。

研究表明,苦參素(matrine)可有效阻遏AS的發生發展,但具體的分子機制上不完全清楚。根據課題組的前期研究結果,苦參素對糖尿病狀態下細胞內ERS PERK信號通路具有顯著的抑制作用[8]。據此,我們推測苦參素可能通過抑制AGEs誘導的VSMCs PERK信號通路激活降低細胞表面Dll4的表達水平,從而抑制VSMCs收縮型-合成型細胞表型轉化,進而遏制AS。因此,本研究通過對苦參素抑制糖尿病相關AS相關分子機制進行探討,旨在為苦參素在本病的臨床治療應用中提供重要的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)購自美國Hyclone公司;甘油醛購自美國Sigma-Aldrich公司;PD-10脫鹽柱購自美國GE Healthcare公司;SignalSilence PERK siRNA試劑盒以及SignalSilence Scramble siRNA試劑盒均購自美國CST公司,Mirus TransIT-TKO試劑盒購自美國Mirus公司;滑肌肌球蛋白重鏈11(smooth muscle myosin heavy chain 11, MYH11)抗體、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)抗體、葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)抗體、磷酸化PERK(p-PERK)抗體、PERK抗體以及GAPDH抗體均購自美國Abcam公司;δ樣蛋白-4(delta-like 4, Dll4)、Notch受體胞內結合域1(Notch intracellular domain 1, NICD1)以及Split多毛增強子1(enhancer of split protein 1, HES1)以及發狀分裂相關增強子2(YRPW motif protein 2, HEY2)抗體均購自美國CST公司;Alexa-488熒光二抗購自美國Invitrogen公司;苦參素購自美國Sigma-Alderich公司。

1.2 AGEs制備

AGEs的制備方法及步驟參考本課題組及既往文獻[3]中的描述進行。在無菌條件下,將BSA與0.1 mmol/L甘油醛在0.2 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH=7.4)中充分混合,37 ℃孵育7 d。使用PD-10脫鹽柱層析法去除未形成基團的糖類。將未與甘油醛混合的BSA作為對照。

1.3 細胞培養、處理與分組

復蘇本實驗室留存的人血管平滑肌細胞(HVSMCs,ATCC來源)并接種于含10%胎牛血清(BSA)及抗生素的DMEM培養基中,在5%CO2、95%新鮮空氣、飽和濕度及37 ℃條件下進行培養,當細胞融合程度>80%時進行后續實驗。根據對細胞的處理方式不同,分為對照組(control)、低劑量AGEs組(L-AGEs)、高劑量AGEs組(H-AGEs)、低劑量苦參素組(AGEs+L-Mat)、中劑量苦參素組(AGEs+M-Mat)以及高劑量苦參素組(AGEs+H-Mat)。其中control組為空白對照;L-AGEs組以濃度為5 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h;H-AGEs組以濃度為10 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h;AGEs+L-Mat組以濃度為0.25 mmol/L的苦參素溶液預處理48 h后再以終濃度為10 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h;AGEs+M-Mat組以濃度為0.5 mmol/L的苦參素溶液預處理48 h后再以終濃度為10 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h;AGEs+H-Mat組以濃度為1.0 mmol/L的苦參素溶液預處理48 h后再以終濃度為10 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h。下文中各檢測均在此分組基礎上進行。

1.4 免疫熒光染色檢測HVSMCs收縮型表型標志物表達水平

將HVSMCs制成細胞爬片并用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。4%多聚甲醛固定20 min,0.2% Triton X-100孵育10 min。PBS漂洗3次后,封閉緩沖液封閉30 min。分別與HVSMCs收縮型表型表面標記物MYH11抗體(1 ∶500)在4 ℃孵育10 h,PBS漂洗后,Alexa-488熒光二抗37 ℃孵育2 h。在倒置熒光顯微鏡下進行觀察并使用image J軟件(版本號1.38)進行分析。

1.5 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞培養液炎癥因子濃度

無菌管收集各組細胞培養上清液,4 ℃以2 000 r/min離心15 min后棄去沉淀,收集上清液分裝備用。以IL-1β及TNF-α ELISA試劑盒對上述標本中IL-1β及TNF-α濃度進行檢測,檢測流程參照試劑盒說明書進行。

1.6 蛋白免疫印跡檢測蛋白表達及PERK磷酸化水平

以RIPA裂解液處理收集的HVSMCs細胞,低溫離心后,使用總蛋白抽提試劑盒提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白后電轉印至PVDF膜。封閉緩沖液孵育后,分別使用GRP78抗體(1 ∶500),磷酸化PERK(p-PERK,1 ∶1 000),PERK(1 ∶1 000),Dll4(1 ∶500),NICD1(1 ∶500),HES1(1 ∶500),HEY2(1 ∶500)以及GAPDH抗體(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育10 h。TBST洗滌后,與相應二抗室溫下孵育30 min,ECL顯色法顯色并捕捉圖像,Image J Pro軟件對條帶灰度進行分析。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 苦參素顯著抑制AGEs誘導的HVSMCs收縮型-合成型細胞表型轉化

與control組相比,L-AGEs組及H-AGEs組HVSMCs收縮型表型標記物MYH11表達水平均顯著降低(P<0.05),H-AGEs組MYH11表達水平較L-AGEs組顯著降低(P<0.05)。與H-AGEs組相比,AGEs+L-Mat組、AGEs+M-Mat組及AGEs+H-Mat組HVSMCs細胞標記物MYH11表達水平顯著升高(均P<0.05),且呈苦參素濃度依賴性(均P<0.05,見圖1)。

2.2 苦參素顯著抑制AGEs誘導的HVSMCs細胞炎性細胞因子分泌

本研究以ELISA法對HVSMCs細胞培養液中促炎因子IL-1β及TNF-α水平進行檢測,結果見圖2。與control組相比,L-AGEs組及H-AGEs組HVSMCs細胞培養上清液中IL-1β及TNF-α水平均顯著升高(P<0.05),且H-AGEs組較L-AGEs組顯著升高(P<0.05)。與H-AGEs組相比,AGEs+L-Mat組、AGEs+M-Mat組及AGEs+H-Mat組HVSMCs細胞培養上清液中L-1β及TNF-α水平顯著降低,且呈苦參素濃度依賴性(均P<0.05)。

與control組相比,aP<0.05;與L-AGEs組相比,bP<0.05;與H-AGEs組相比,cP<0.05;與AGEs+L-Mat組相比,dP<0.05;與AGEs+M-Mat組相比,eP<0.05圖1 免疫熒光檢測HVSMCs收縮型表型標記物MYH11表達水平 (×400)Figure 1 Expression of HVSMCs contractile phenotype marker MYH11 by immunofluorescent staining (×400)

與control組相比,aP<0.05;與L-AGEs組相比,bP<0.05;與H-AGEs組相比,cP<0.05;與AGEs+L-Mat組相比,dP<0.05;與AGEs+M-Mat組相比,eP<0.05圖2 ELISA法檢測HVSMCs細胞培養上清液IL-1β及TNF-α濃度Figure 2 Concentrations of IL-1β and TNF-α in medium supernatant of HVSMCs by ELISA

2.3 苦參素顯著抑制AGEs誘導的HVSMCs細胞ERS PERK/Dll4信號通路激活

Werstern blotting結果顯示,與control組相比,L-AGEs組及H-AGEs組HVSMCs內GRP78、Dll4表達水平以及PERK磷酸化水平均顯著升高,且H-AGEs組較L-AGEs組顯著升高(均P<0.05)。與H-AGEs組相比,AGEs+L-Mat組、AGEs+M-Mat組及AGEs+H-Mat組HVSMCs內GRP78、Dll4表達水平以及PERK磷酸化水平均顯著降低,且呈現苦參素濃度依賴性(均P<0.05,見圖3)。

2.4 PERK敲減可顯著抑制AGEs誘導的HVSMCs內Dll4/Notch信號通路激活

Western blotting結果顯示,與control組相比,L-AGEs及H-AGEs組HVSMCs內NICD1、HEY2以及HES1表達水平均顯著升高,且H-AGEs組較L-AGEs組顯著升高(均P<0.05)。與H-AGEs組相比,AGEs+L-Mat組、AGEs+M-Mat組及AGEs+H-Mat組HVSMCs內NICD1、HEY2以及HES1表達水平顯著降低,且呈苦參素濃度依賴性(均P<0.05,見圖4)。

與control組相比,aP<0.05;與L-AGEs組相比,bP<0.05;與H-AGEs組相比,cP<0.05;與AGEs+L-Mat組相比,dP<0.05;與AGEs+M-Mat組相比,eP<0.05圖3 Western blotting法檢測HVSMCs GRP78、Dll4表達水平及PERK磷酸化水平Figure 3 Relative expression levels of GRP78, Dll4 and relative phosphorylation level of PERK in HVSMCs by Western blotting

與control組相比,aP<0.05;與L-AGEs組相比,bP<0.05;與H-AGEs組相比,cP<0.05;與AGEs+L-Mat組相比,dP<0.05;與AGEs+M-Mat組相比,eP<0.05圖4 Western blotting法檢測HVSMCs內NICD1、HES1以及HEY2表達水平Figure 4 Relative expression levels of NICD1, HES1 and HEY2 in HVSMCs by Western blotting

3 討論

AGEs是DM患者體內異常代謝產物的代表之一,在持續的控制不佳的高血糖狀態下,蛋白質、核酸以及脂質發生Maillard反應,形成Schiff堿,后者經過Amadori反應生成一系列結構多樣的具有高度生物學活性的產物[9]。既往研究表明,AGEs與DM患者主要心血管事件(MACE)的發生密切相關[1]。在本課題組的前期系列研究中,相繼發現AGEs可作用于心肌細胞以及動脈內皮細胞,通過誘導細胞凋亡以及局部炎癥等參與DM相關心血管并發癥的發生發展[10-13]。

VSMCs是動脈血管壁的重要細胞成分,在不同病理生理條件下可表現出不同的細胞表型,即VSMCs的表型轉化。在一些病理因素的刺激下,VSMCs出現收縮型表型向合成型表型的轉化,表現為VSMCs內肌絲纖維減少以及炎性因子及細胞外基質蛋白合成分泌異?；钴S[14]。喪失了收縮型表型特征的VSMCs可向合成型表型轉化。合成型VSMCs具有產生和分泌細胞外基質以及炎癥性細胞因子的特點,進而對AS斑塊的形成、進展以及易損性表現出促進作用[14]。本研究結果表明,AGEs可使VSMCs細胞表面收縮型表面標記物MYH11表達水平下降,同時VSMCs分泌的炎性因子水平顯著升高,表明AGEs可使VSMCs喪失收縮型表型特征,向合成型表型轉化。

在有害病理因子的作用下,ER功能受損便可誘發ERS,并通過其下游的PERK等信號通路產生各種生物學效應[15]。本研究結果顯示,AGEs處理可使VSMCs細胞內GRP78表達水平及PERK磷酸化水平顯著升高。GRP78是ERS激活的分子標志物,PERK信號通路則通過其自身磷酸化激活。本研究結果表明,AGEs可使VSMCs內PERK磷酸化水平顯著升高,說明AGEs可誘導VSMCs內ERS PERK信號通路激活。除了依賴帽結構的翻譯,還有一種依賴5′非翻譯區(5′-UTR)的內部核糖體進入位點(IRES)機制可在ERS狀態下起到指導蛋白翻譯的作用。一項研究表明,處于ERS狀態的細胞可通過PERK信號通路的活化,經由5′-UTR IRES機制促進Dll4的表達[5]。作為配體,Dll4可通過與細胞表面的Notch受體結合而激活Notch信號通路。

目前認為,Notch通路是VSMCs發生收縮型-合成型表型轉化的關鍵信號通路。Notch信號通激活后,furin對Notch進行切割,后者發生裂解,Notch胞內段(Notch intracellular domain, NICD)被釋放進入胞漿,發生核轉位后與轉錄因子CBF-1/RBP-Jκ及Mastermind結合形成三元絡合物,激活下游的Hey以及Hes等靶基因的轉錄[16]。HEY2可以通過抑制多個轉錄調控元件(transcriptional regulatory elements)活性而降低例如MYH11等收縮蛋白的表達[17]。HES則被證明可促進膠原蛋白等靶基因啟動子的活性,參與細胞外基質的分泌[18]。本研究發現,AGEs可誘發VSMCs內Notch信號通路的激活,通過NICD1、HEY2以及HES1等效應分子參與VSMCs收縮型-合成型表型轉化。

近年來藥理學研究顯示苦參素具有多種藥理學活性,本課題組前期研究結果也證實了苦參素具有心血管保護作用。前期研究結果還表明,苦參素對氧化應激依賴的內質網應激有顯著的抑制作用[8]。本研究以不同劑量苦參素對AGEs暴露的VSMCs進行預處理,發現苦參素預處理能夠顯著抑制VSMCs內質網應激,降低下游PERK信號通路的活性,從而抑制VSMCs Dll4的表達水平,進而抑制細胞內Notch信號通路的激活,最終抑制VSMCs由收縮型向合成型的表型轉化。綜上所述,苦參素可抑制AGEs激活的內質網應激PERK/Dll4/Notch信號通路誘導的VSMCs收縮型-合成型細胞表型轉化。該機制可能是苦參素抑制動脈粥樣硬化的重要分子機制之一。