免疫檢查點阻斷劑PD-1抗體在小鼠肝細胞癌治療中的應用

買為麗旦·衣明江，塔來提·吐爾干，陳新華，吐爾干艾力·阿吉，張瑞青，張 巍

(新疆醫科大學第一附屬醫院病理科，烏魯木齊 830054；*通訊作者,E-mail:zwyhr100@163.com)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第五大常見腫瘤，每年新發病高達80萬例，占原發性肝臟腫瘤的90%[1]，是我國惡性腫瘤繼肺癌之后的第2位，發病率呈逐年上升趨勢。HCC起病隱匿，潛伏期長，患者早期通常沒有特殊癥狀，而一旦發病，往往已是中、晚期，病情發展迅速，預后極差，死亡率高[2]。HCC的治療以手術及放化療為主，近年來正在發展中的局部消融治療、免疫治療等逐漸成為肝癌治療的新策略[3,4]。免疫檢查點(immune checkpoint)是人體免疫系統中起保護作用的分子，免疫檢查點分子過表達會抑制腫瘤特異性T淋巴細胞的免疫活性，促進腫瘤的進展?；谶@一機制，利用針對免疫檢查點分子或配體的單克隆抗體阻斷其信號傳遞，可以恢復細胞毒性T細胞活性，從而誘導針對腫瘤細胞的特異性免疫反應。免疫檢查點是腫瘤免疫逃逸的主要機制之一，其中最重要的是程序性細胞死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)/程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)。PD-1為免疫阻斷性受體，主要在周圍組織和腫瘤微環境中與它的配體PD-L1和PD-L2相互作用，從而抑制T細胞增殖、活化和分泌細胞因子[5,6]。使用PD-1受體拮抗劑可改善機體免疫抑制狀態，增強機體抗腫瘤免疫效應，已在一些實體腫瘤中取得了一定的療效，但在肝癌患者中有效率低于30%[2,5]，這可能與肝癌免疫微環境耐受及免疫細胞浸潤不足有關[7]，但PD-1抗體對肝癌免疫微環境中各個免疫細胞的具體影響需進一步研究。本實驗通過小鼠原位肝癌模型觀察PD-1阻斷劑在HCC中的治療效果和腫瘤微環境的變化，為PD-1阻斷劑的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

28只6-8周齡雌性SPF級C57BL/6J小鼠購自新疆醫科大學動物實驗中心，生產許可證號：SYXK(新)2018-0003，實驗動物質量合格證：65000700001067。本實驗經新疆醫科大學實驗動物福利倫理委員會審查批準，倫理審批號：IACUC20181203-01。

1.2 細胞株及主要試劑

鼠源性Hepa1-6肝癌細胞株由浙江大學陳新華教授惠贈。PD-1抗體(BioXcell，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，DMEM培養基(Gibco，美國)，淋巴細胞分離液(北京達科為生物技術有限公司)；免疫細胞檢測使用CD45-PC7-A、CD3-PECY5、CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PECY5、CD19 FITC-A和NK1.1-PECY7流式抗體，購自eBioscience(美國)。Th1類細胞因子檢測使用LEGENDplexTMMouse Th Cytokine Panel(13-plex)，購自Biolegend(美國)。

1.3 細胞培養和小鼠原位肝癌模型的建立

常規復蘇Hepa1-6肝癌細胞株，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2孵育箱中培養并傳代。將對數生長期的細胞濃度調至1×106/ml。通過腹腔注射1%戊巴比妥(60 mg/kg)麻醉小鼠，麻醉見效后剖開小鼠腹腔，暴露小鼠肝臟，取50 μl細胞懸液與matrigel基質膠混合，接種在肝左葉包膜下[8]。建模全過程無菌操作。

1.4 PD-1抗體阻斷實驗

建模完成后第8天，將小鼠隨機分為治療組和模型組，每組14只，8只取標本，6只觀察生存狀態。治療組將PD-1抗體溶于500 μl的PBS中，每只小鼠腹腔注射200 μg PD-1抗體，每3 d一次，共注射3次[9]，模型組注射相同劑量的生理鹽水。治療后每天觀察兩組小鼠生存狀態。

1.5 腫瘤組織HE染色及病理學評估

治療結束后第2天，每組隨機選擇8只小鼠，通過摘眼球法取外周血后，處死小鼠取腫瘤組織，測量腫瘤組織標本最大直徑，對比兩組小鼠腫瘤組織大小，并通過HE染色觀察兩組標本病理特點。腫瘤組織標本用3%中性多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，制成3 μm厚的連續切片，二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，將切片置于蘇木素染色2-4 min，鹽酸乙醇中分化以及自來水中返藍；切片置于伊紅染色液中1-2 min，脫水、透明、中性樹脂封片，光鏡觀察病理形態學改變。

1.6 流式細胞術檢測腫瘤組織T、B、NK細胞及外周血Th1類細胞因子

外周血分離血清，用LEGENDplexTMMouse Th Cytokine Panel (13-plex)試劑盒檢測IL-2、IFN-γ、TNF-α濃度。取腫瘤組織制備單細胞懸液，以CD45-PC7-A為對照抗體，分別用抗T淋巴細胞(CD3-PECY5、CD4-FITC、CD8-PE)、B淋巴細胞(CD3-PECY5、CD19 FITC-A)、NK細胞(NK1.1-PECY7)抗體，使用DxFLEX(Beckman)流式細胞儀檢測CD3+T、CD4+T、CD8+T、B和NK細胞比例。實驗步驟按照抗體試劑盒說明書進行，所有數據采用Kaluza軟件進行分析。

1.7 統計學分析

實驗數據采用SPSS 23和GraphPad Prism7(Version 7.00, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)軟件分析，應用獨立樣本t檢驗比較兩組小鼠腫瘤大小，應用雙因素方差分析比較兩組間T、B、NK細胞比例和細胞因子濃度的差異；用KaplanMeierr生存曲線法及Log-rank檢驗比較兩組間生存期的差異，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-1抗體治療對腫瘤大小及病理特征的影響

治療組和模型組小鼠腫瘤直徑分別是(9.011±0.38)mm和(11.93±0.68)mm，治療組小鼠腫瘤直徑明顯小于模型組(t=3.74，P=0.002)。HE染色顯示，模型組腫瘤細胞實性片狀分布、核異型性明顯、可見核分裂，符合肝細胞肝癌的病理形態學特征，并腫瘤內可見少量炎性細胞(見圖1)。治療組腫瘤間質纖維化、病灶出現不同程度的腫瘤細胞壞死融合，有彌散炎性細胞浸潤(見圖1)。

圖1 小鼠腫瘤組織HE染色Figure 1 HE staining of mouse tumor tissue

2.2 PD-1抗體治療對腫瘤局部免疫的影響

流式細胞術檢測結果顯示，治療組小鼠腫瘤組織總T細胞比例明顯高于模型組(P<0.001)；CD4+T和CD8+T細胞比例均明顯高于模型組，差異具有統計學意義(分別P<0.001和P=0.001，見圖2)。

與對照組比較，**P<0.01，***P<0.01圖2 流式細胞術檢測PD-1抗體對小鼠腫瘤組織T細胞比例的影響Figure 2 Effect of PD-1 antibody on T cell proportion in mouse tumor tissue by flow cytometry

為了了解PD-1抗體對體液免疫和固有免疫的的影響，檢測腫瘤組織B淋巴細胞和NK細胞比例，結果顯示，PD-1抗體治療組B淋巴細胞和NK細胞比例均明顯高于模型組，差異具有統計學意義(均P<0.001，見圖3)。

圖3 流式細胞術檢測PD-1抗體對小鼠腫瘤組織B和NK細胞比例的影響Figure 3 Effect of PD-1 antibody on the proportions of B,NK cells in mouse tumor tissue by flow cytometry

2.3 PD-1抗體治療對外周血細胞因子的影響

PD-1抗體治療組小鼠外周血IL-2濃度明顯高于模型組(P<0.001)；兩組間IFN-γ和TNF-α濃度的差異無統計學意義(P>0.05，見圖4)。

2.4 PD-1抗體治療對小鼠生存期的影響

為了進一步確定PD-1抗體在小鼠原位肝癌中的治療作用，進行Kaplan-Meier生存分析，采用Log-rank檢驗觀察兩組小鼠生存期并分別計算中位生存時間。結果顯示，PD-1抗體治療組小鼠中位生存時間為34 d，模型組小鼠為15 d，PD-1抗體治療組小鼠中位生存時間顯著延長(P=0.04，見圖5)。

與對照組比較，***P<0.001圖4 PD-1抗體對小鼠外周血Th1類細胞因子濃度的影響Figure 4 Effect of PD-1 antibody on the blood concentration of Th1 cytokines

圖5 PD-1抗體對小鼠生存期的影響Figure 5 Effect of PD-1 antibody on survival time of mice

3 討論

腫瘤免疫治療作為一種嶄新的治療手段，具備多方面的獨特優勢，既可以治療原發腫瘤，又可以抑制腫瘤復發、減少遠處轉移[10,11]。盡管生物免疫治療有可能徹底治愈惡性腫瘤，并在某些實體惡性腫瘤的治療上取得極為顯著的療效，然而，在肝癌的免疫治療方面，至今仍未見革命性突破效果。肝癌免疫治療藥物的種類及其療效仍然非常有限，針對肝癌免疫治療的臨床試驗數量仍不多。究其原因，主要是由于肝臟所特有的免疫抑制狀態和未能找到理想的相關抗原靶點[12]。近年來，PD-1受體阻斷劑在多種惡性腫瘤(如黑色素瘤、非小細胞肺癌及腎細胞癌等)的臨床應用中已取得很好的成果[6,13-21]。應用PD-1阻斷劑可恢復T細胞的活性及功能，減輕患者免疫抑制狀態，從而達到抗腫瘤的目的[22]。更重要的是，PD-1抑制劑的制備選用的大都是IgG4或者經過改造的IgG1亞型抗體，其天然的抗體依賴的細胞毒性效應(ADCC)很弱，補體依賴的細胞毒性效應(CDC)也幾乎沒有，從而避免了對T淋巴細胞的殺傷作用[23]。目前多個抗PD-1/PD-L1治療肝癌的臨床研究正在進行中。

PD-1抗體可以通過促進T淋巴細胞增殖、活化發揮其抗腫瘤效應[24]，本實驗通過小鼠原位肝癌模型觀察腫瘤組織T淋巴細胞比例的改變，結果顯示，腫瘤組織總T、CD4+T和CD8+T淋巴細胞比例均升高，且PD-1抗體治療組小鼠生存期明顯延長。研究證明[25]，腫瘤組織中浸潤性T細胞的數量和患者的預后呈正相關，CD8+T細胞數量的增加能夠控制腫瘤的生長及延長生存期。CD4+T細胞通過多種機制促進抗腫瘤免疫，不僅輔助激活CD8+T淋巴細胞，還參與B淋巴細胞和巨噬細胞活化，并能吸引NK細胞到腫瘤局部，以發揮抗腫瘤作用。除此之外，CD4+T淋巴細胞通過與腫瘤細胞直接接觸介導其凋亡[26]。本研究結果顯示，PD-1抗體治療后小鼠腫瘤組織B和NK細胞比例顯著升高，這提示，PD-1抗體治療在肝癌微環境中，對B細胞和NK細胞介導的免疫反應亦有一定的增強作用。B淋巴細胞是通過產生特異性抗體和呈遞抗原從而促進免疫效應，并通過抗體依賴的、細胞介導的細胞毒作用，補體結合作用等機制發揮抗腫瘤作用，在機體體液免疫應答中占主導地位。而腫瘤浸潤性NK細胞比例通常與癌癥患者的預后密切相關,高比例患者預后比較好[27]。

腫瘤發生后，機體可以通過多種機制發揮抗腫瘤作用，其中輔助性T細胞(helper T lymphocyte，Th)無論在體液免疫還是細胞免疫中都發揮不可或缺的重要作用，根據其功能不同，Th細胞分為Thl和Th2兩個亞群。研究表明，以IL-2和IFN-γ介導的Thl為主的細胞免疫在清除腫瘤及獲得記憶性細胞免疫中起關鍵作用[28-29]，當機體Thl細胞和及其分泌的細胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α占優勢，則提示機體對腫瘤具有較強的免疫力，在決定抗腫瘤免疫治療是否成功方面起到了重要作用[30]。其中IL-2是機體免疫應答中起重要調節作用的細胞因子，能促進T淋巴細胞和NK細胞增殖、活化、促進B淋巴細胞增殖、分化和分泌抗體。本研究結果顯示，PD-1抗體治療組外周血IL-2和IFN-γ濃度均高于模型組，其中IL-2濃度在兩組間的差異有顯著的統計學意義。這說明，PD-1抗體治療可以上調外周血IL-2濃度，從而增強機體抗腫瘤免疫應答。綜上所述，PD-1抗體治療可以明顯改善原位肝癌模型小鼠免疫微環境，并增強系統性抗腫瘤免疫應答，從而顯著延長小鼠生存時間，這結果為肝癌免疫檢查點阻斷治療提供了實驗和理論依據。