液相色譜法測定小麥粉中赭曲霉毒素A不確定度評估

王玉梅，劉 真，李 丹，楊軍麗

（南京市食品藥品監督檢驗院，江蘇南京 211198）

赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）是由多種青霉屬和曲霉屬真菌產生的代謝產物，目前在多種糧食及制品中都檢測出OTA的情況[1]。人和動物進食被OTA污染的食物后，由于OTA在體內代謝較慢，會在體內蓄積，目前糧食及其制品中的OTA的檢測情況已引起國內外的高度關注[2]。我國目前還沒有關于人群OTA膳食攝入量的評價研究，但食品安全國家標準規定了谷物等糧食及制品中OTA的限量為5 μg/kg，同時指明了其方法標準為GB 5009.96—2016[3]。本文參照《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[4]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[5]，依據《食品安全國家標準 食品中赭曲霉毒素A的測定》（GB 5009.96—2016）[3]分析小麥粉中赭曲霉毒素A的不確定度，為實驗室質量控制提供科學準確的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赭曲霉毒素A標準品（PriboFast，CAS號303-47-9，純度為99.0%）；色譜級乙腈、甲醇、冰乙酸；分析純氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、濃鹽酸；陽性小麥粉樣品（實驗室自制）。

1.2 儀器與設備

島津液相色譜儀（LC-20AD）；電子天平；離心機；渦旋振蕩器；赭曲霉毒素A免疫親和柱（PriboFast，≥100 mg，3 mL），定量濾紙，玻璃纖維濾紙。

1.3 前處理方法

按GB 5009.96—2016[3]標準方法。糧食和糧食制品。樣品需全部粉碎且通過孔徑1 mm的篩后混勻后備用。稱取試樣25.0 g，加入100 mL乙腈水溶液（體積比6+4），高速均質3 min，準確量取濾液4 mL后加入26 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），并充分混合均勻，置于高速離心機中離心（10 000 r/min，5 min），取上清待過柱備用。將全部濾液過赭曲霉毒素A免疫親和柱（PriboFast，≥100 mg，3 mL），依次使用10 mL PBS緩沖液、10 mL水淋洗赭曲霉毒素A免疫親和柱，棄去流出液并抽干小柱，最后使用1.5 mL的甲醇洗脫，用干凈離心管收集洗脫液，置于氮氣儀吹干（45 ℃）。用流動相溶解殘渣并定容到500 μL，供上機檢測。

1.4 樣品中赭曲霉毒素A殘留量計算

樣品中赭曲霉毒素A殘留量計算如式（1）所示。

式中：X—樣品中赭曲霉毒素A殘留量，μg/kg；C—儀器檢出目標物濃度，ng/mL；V—試樣最終定容體積，mL；m—樣品稱樣量，g；K—稀釋倍數，K=25。

2 結果與分析

2.1 儀器測定赭曲霉毒素A含量C產生的不確定度

赭曲霉毒素A含量的不確定度主要包括以下兩個方面，即配制標準儲備溶液產生的不確定度，標準曲線配制產生的不確定度。

2.1.1 標準儲備液配制產生的不確定度Uc(1)

于10 mL容量瓶中放入準確稱取的10 mg的赭曲霉毒素A標準品（純度＞99%），用甲醇溶解后并定容至容量瓶刻度，得到標準儲備液，其濃度為1 000 μg/mL。

（1）赭曲霉毒素A標準品純度產生的不確定度。從其標準物質證書中獲取相關信息，赭曲霉毒素A標準品的純度＞99%，按均勻分布來計算，由其純度產生的相對不確定度分別為

（2）稱量赭曲霉毒素A標準品產生的不確定度?！稊底种甘境印罚↗JG 539—2016）標準中規定了：在0～5 g稱量范圍內，電子天平的最大允許誤差為±0.05 mg，因此可以得到天平稱量標準品時的產生的相對不確定度為

（3）配制赭曲霉毒素A標準儲備液時由定容體積產生的不確定度?！冻Ｓ貌ＡЯ科鳈z定規程》（JJG 196—2006）[6]標準中規定，溫度為20 ℃時100 mL的A級容量瓶允差誤差為±0.1 mL，按對稱分布計算不確定度為溫度為20 ℃，定容液甲醇的體積膨脹系數為1.1×10-3/℃，按均勻分布計算，100 mL的容量瓶由溫度產生的體積不確定度為綜合以上兩部分合成得到的相對標準不確定度為

2.1.2 稀釋赭曲霉毒素A標準儲備液過程中產生的不確定度Uc(2)

火燒油層技術雖然驅油效果較好，但其有諸多技術難點：無法控制地下真實燃燒狀態；對燃燒帶前緣的調整與控制；點火、注氣、舉升工藝對裝備的要求較高；產出流體的檢測和安全環?？刂戚^難。

稀釋過程中使用1 mL的移液管移取赭曲霉毒素A標準儲備液1 mL于100 mL A級容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，得到濃度為10 μg/mL標準中間溶液1；移取1 mL標準中間溶液1,用甲醇定容于100 mL A級容量瓶中，得到標準中間溶液2，濃度為100 ng/mL。取均勻分布，產生的不確定度見表1。

表1 稀釋赭曲霉毒素A標準儲備液過程中引入的不確定度

由儲備液稀釋過程產生的相對標準不確定度為：

2.1.3 赭曲霉毒素A標準曲線制作及擬合產生的不確定度Uc(3)

移取適量流動相將赭曲霉毒素A標準溶液稀釋成濃度為 0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL的標準系列溶液，進樣體積為50 μL，每個點均平行測定2次，測定數據見表2。

表2 赭曲霉毒素A標準曲線數據

取陽性小麥粉樣品，對其中赭曲霉毒素A濃度C0進行2次重復檢測，結果見表3。通過高效液相色譜自動定量軟件分析得到相應色譜峰面積A，擬合得到線性回歸方程Ai=aCi+b，其中a為斜率，b為截距。

表3 陽性小麥粉樣品測量數據

由標準曲線擬合產生的不確定度為

Uc(3)=，其中SR為標準溶液峰面積殘差的標準差n為測試次數，本試驗中n=7×2=14；p為對C0的測定次數，為標準溶液平均濃度，則Uc(3)=0.742 1，0.032 89。

2.2 測量重復性產生的不確定度U()

在空白小麥粉試樣中添加1.0 μg/kg的赭曲霉毒素A標準溶液，平行測定6次，測定結果見表4。計算得到

表4 小麥粉中赭曲霉毒素A測定結果

2.3 由試驗回收率引入的不確定度U(R)

2.4 稱量樣品時產生的不確定U(m)

按本試驗要求，稱取小麥粉25 g，電子天平最大允差是±0.005 g，取均勻分布，其產生的相對不確定度為

2.5 量取體積時產生的不確定U(V)

量取體積產生的不確定度主要分為定容體積和進樣體積兩部分引入的不確定度組成。

2.5.1 定容體積產生的不確定度U(V1)

小麥粉樣品按照試驗方法經提取凈化，最終使用1 mL A級移液管定容至0.50 mL，允差為±0.007 mL，取均勻分布，其相對不確定度為

2.5.2 上機體積產生的不確定度U(V2)

高效液相色譜進樣針容積相對標準偏差為±1%，取均勻分布，其相對不確定度

結合以上兩部分引入的不確定度，由體積量取引入的合成不確定度為

3 合成不確定度

U(x)=依據JJF 1135—2005[5]，在95.45%的置信水平下，取包含因子k=2，赭曲霉毒素A的測定值為1.12 μg/kg，擴展不確定度

4 測定結果

按照該方法測定小麥粉中赭曲霉毒素A的結果為：