miR-708在兒童急性淋巴細胞白血病中的診斷及預后

王麗娟，劉 燕

（1.中原油田疾控中心臨床醫療科，河南濮陽 457000； 2.中原油田總醫院核醫學科）

淋巴母細胞性白血病是一種惡性腫瘤，其中兒童急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）占所有兒童癌癥的25%以上[1-2]。為提高兒童ALL的診治效率，急需尋找與兒童ALL相關的有效生物標志物。

miRNA是一種非編碼的單鏈小RNA，研究報道，改變miRNA表達水平與一些實體腫瘤和血液腫瘤息息相關[3-4]，例如肺癌[5]和慢性淋巴細胞白血病[6]等。另有研究表明某些miRNA可以作為ALL診斷的分子標記物[7]。MicroRNA-708（miR-708）的異常表達與細胞遷移、侵襲、凋亡和增殖密切相關[8]，然而，miR-708在ALL中臨床價值的相關研究較少。

本研究通過分析miR-708在兒童ALL患者血樣中的表達水平，評估miR-708是否可以作為兒童ALL診斷和預后的分子標記物，以期對兒童ALL的臨床治療提供有效策略。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

采集2015年5月～2016年5月自我院就診的110例兒童外周血液樣本（ALL血樣90例，健康血樣20例），其中ALL血樣來自我院兒科腫瘤科。經過臨床、形態、細胞化學、流式細胞儀和細胞遺傳學分析后確定免疫表型和遺傳亞型，其中包括79例急性前B淋巴細胞白血?。╬re-B lymphocytic leukemia，Pre-B-ALL）以及11例急性T淋巴細胞白血?。╝cute T lymphocytic leukemia，T-ALL），所有病例均符合ALL診斷標準。從每位新診斷為兒童ALL患者和健康兒童對照組中采集3～6ml血液樣本。本次實驗已獲得兒童法定監護人的知情同意和本市倫理委員會的批準。

1.2 實時熒光定量PCR

按照制造廠家的建議并遵循Trizol試劑盒（Thermo Fisher）說明書的實驗步驟提取兒童血液樣本中的總RNA，并在260nm和280nm處用分光光度法測定提取的RNA的濃度和純度；以OligodT為引物，并按照反轉錄試劑盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor，貨號：4374967，Thermo Fisher）的實驗步驟，反轉錄得到與miR-708互補的cDNA；按照Fast SYBR?Green Cells-to-CT?Kit 試劑盒（Thermo Fisher，貨號：4402956）實驗步驟，在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上進行qRT-PCR，實驗以U6作為內參基因，利用2-ΔΔCT方法計算miR-708在血液樣本中的表達水平。qRT-PCR反應條件為：95°C持續10min，95°C持續15s，60°C持續1min并做40個循環。qRT-PCR所需引物見表1：

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 隨訪

所有兒童ALL患者每月隨訪一次，隨訪的辦法主要是檢測患者血液中miR-708的表達水平，來推測患者預后效果?；颊叩碾S訪期為患者接受治療開始算起截止到2020年5月。一共有90名患者隨訪了10～60個月，期間有2個患者失訪，總隨訪率為97.78%。無進展生存期的定義為從治療之日至復發之前的生存時間，總生存期的定義為從治療之日到死亡或失訪所經歷的時間。

1.4 統計方法

所有實驗至少獨立重復3次，數據表示為平均值±標準偏差（mean±SD）。所有研究數據均應用GraphPad Prism 6.0和SPSS 19.0統計軟件進行分析和處理。利用非配對t檢驗、χ2檢驗、Fisher精確檢驗，檢測兩組數據之間的差異；利用Kaplan-Meier方法進行生存分析，并使用對數秩檢驗進行miR-708高、低表達組生存曲線之間的比較；應用接受者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估miR-708的診斷潛力，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-708在兒童ALL患者中顯著上調

實驗研究對象分為兩組，其中確診為ALL的為患者組共90例（81.82%），健康對照組20例（18.18%）。實驗中使用qRT-PCR檢測所有血液樣本中miR-708表達水平。實驗數據表明，患者組中miR-708顯著上調。見圖1：

圖1 miR-708表達水平箱型圖

2.2 miR-708在兒童ALL患者中的診斷意義

通過繪制受試者操作特征曲線以檢測候選miR-708的診斷價值，ROC曲線數據顯示miR-708的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.882，敏感度為92.2%，特異性為80.0%，Cut Off值為42.13，約登指數為0.722，95%置信區間（95% Confidence interval，CI）為0.777～0.986。AUC值＞0.5說明miR-708在兒童ALL中具有良好的診斷潛力，約登指數說明miR-708作為篩選條件辨別患者與非患者的總能力較高，并且靈敏度和特異性較好。見圖2：

圖2 miR-708在兒童ALL中的診斷價值

2.3 miR-708表達水平與兒童ALL患者臨床病理特征因素之間的關系

以miR-708表達水平的ROC曲線中的Cut off值（42.13）作為臨界值，將患者分為高表達組（n=50）和低表達組（n=40），并利用Fisher精確檢驗或者χ2檢驗檢測miR-708的表達水平與兒童ALL患者臨床病理因素之間的相關性。其中性別、白細胞數量、是否涉及中樞神經系統（central nervous system，CNS）、第33天的微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）與miR-708的表達水平無明顯相關性（P＞0.05），而年齡和免疫分型與miR-708的表達水平顯著相關，見表2：

表2 miR-708 表達水平與兒童ALL患者臨床病理因素之間的關系

2.4 兒童年齡和免疫分型與miR-708在ALL患者中的表達顯著相關

由表1可知，兒童年齡和免疫分型都與miR-708在兒童ALL患者中的表達水平具有明顯的相關性（P＜0.05）。我們進一步通過箱型圖驗證了兩種病理因素與miR-708的具體相關性。由圖可知，1～9歲ALL兒童患者中的miR-708表達水平顯著高于大于9歲的兒童患者（圖3A）；Pre-BALL兒童患者中的 miR-708表達水平也顯著高于T-ALL患者（圖3B）。

圖3 兒童年齡和免疫分型與miR-708表達顯著相關

2.5 miR-708表達水平在兒童ALL患者中的預后評估

隨訪期間，miR-708高表達組ALL 共有11例復發（復發率為1-無進展生存率），復發率為22.0%，miR-708低表達組ALL 共有1例復發，復發率為2.5%，高表達組復發率遠遠高于低表達組；無進展生存期曲線顯示，miR-708低表達組患者的無進展生存期較高表達組顯著延長（圖4A），具有統計學意義（P=0.024）?？偵嫫谏娣治鼋Y果表明，miR-708高表達組患者和低表達患者總生存率分別為82.0%和97.5%，且miR-708低表達組總生存期明顯較高表達組的總生存期延長（圖4B），說明miR-708低表達組預后效果顯著高于miR-708低表達組（P=0.026）。

圖4 在兒童ALL患者中 miR-708高、低表達組的生存分析

3 討論

ALL作為一種惡性腫瘤在兒童中十分常見，據統計，ALL約占兒童所有癌癥的25%[9]。作為未成熟血細胞前體，即胚細胞癌變和惡性增殖的結果，其特點為增殖速度快且經常沒有明顯的預兆，因此難以發覺[10]。經過生物醫學界幾十年的努力，臨床上改進的抗白血病藥物、化學療法以及放射療法都極大改善了ALL治愈率和生存率，使其治愈率提高了近80%，五年生存率提高了近85%，在ALL治療上取得了極大成功[10-12]。為了提高兒童ALL患者的診斷能力以及臨床治療后的預后情況，臨床上急需一種可靠的生物標志物。本文探討了miR-708作為兒童ALL診斷和預后的生物標記物的可能性。

已有學者表明miRNA可以作為兒童ALL診斷和預后的生物標志物，例如：miR-143和miR-182可以作為兒童ALL經BFM化療治療后的預后分子標記物[13]；miR-200c和miR-326在兒童ALL中具有潛在的診斷作用，miR-326的下調可作為兒童ALL耐藥的預后因素[14]。以上相關研究提示了miRNA在兒童ALL中的臨床診斷和預后意義。

有相關文獻證明，低表達的miR-708與前列腺患者的診斷和不良預后相關[15]；高表達的miR-708可作為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）早期診斷的生物標志物[16]。有相關研究利用微陣列分析（n=43）兒童ALL全基因組的miRNA表達譜，發現在骨髓樣品中包括miR-708在內的13個miRNA均顯著上調[17]。此外，有研究者在B淋巴細胞白血?。˙ lymphocyte leukemia,B-ALL）、T-ALL和急性髓細胞性白血?。╝cute myelocytic leukemia, AML）患者RNA樣本中測量了人類miRNA的表達情況，并利用細胞數據庫構建了miRNA網絡。結果表明，miR-708與以B-ALL為中心的miRNA網絡連接最為緊密，并且在B-ALL網絡中特異性高表達，這提示了miR-708可能作為B-ALL的一種分子標記物。與T-ALL和AML相比，在大多數B-ALL細胞系中的miR-708均上調，這也進一步說明miR-708有可能是B-ALL的生物標志物[18]。有趣的是，有的學者發現miR-708-5p在兒童ALL中的表達很有特點，miR-708-5p相對于整個患者組的BM樣本過表達。然而，當考慮到免疫分型時，miR-708-5p僅在Pre-B-ALL中過表達；在Pre-B-ALL患者中，miR-708-5p表達水平與對照組相當；在T-ALL患者中的表達量顯著低于對照組[19]。實驗中我們采集到了79例Pre-B-ALL兒童血樣和11例T-ALL兒童血樣，并通過qRT-PCR檢測和箱型圖分析得到miR-708在兒童ALL中顯著下調，研究結果與其他學者相一致。

本研究的優點在于，基于前人的研究成果深入探究了miR-708在兒童ALL中的診斷和預后意義。我們的研究結果表明，ROC曲線下面積為0.882，敏感度為92.2%，特異性為80.0%，說明miR-708在兒童ALL中具有良好的診斷潛力，并且敏感度和特異性較高；約登指數為0.722，說明以miR-708作為篩選條件來辨別患者與非患者的總能力較高。無進展生存期曲線顯示miR-708高表達組的復發率顯著高于低表達組，并且低表達組患者的無進展生存期顯著比高表達組的患者延長；總生存期曲線顯示miR-708低表達組預后效果顯著高于miR-708低表達組。但由于本次研究的樣本量較少，使得miR-708在兒童ALL中的表達量的精確度有待提高。在以后的研究中還應加大樣本量，使其在兒童ALL中的診斷和預后價值更為準確可信。

綜上所述，miR-708可以在臨床上作為兒童急性淋巴細胞白血病診斷和預后的生物標志物。