類姜黃素-芳基釕配合物的合成、結構和光照激活抗癌活性

蔣憲濤 王曉輝 李培源 蘇 煒＊,

(1南寧師范大學，廣西天然高分子化學與物理重點實驗室，南寧 530001)

(2廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001)

0 引言

近年來，金屬有機配合物因其對不同癌細胞的特異性活性以及良好的細胞毒性而成為科研工作者的研究熱點[1-2]。其中，釕離子由于其多變的氧化態，在生命體內可以像鐵離子一樣進入代謝循環，幾乎不顯毒性，因此釕配合物成為非常有應用潛力的新型抗癌藥物[3]。例如[HIm][trans-RuCl4(DMSO)(Im)](NAMI-A)和[ImH][trans-RuCl4(Im)2](KP1019)已經成功進入抗腫瘤臨床試驗[4-6]。此外，分子式為[(η6-arene)Ru(X)(Y)(Z)]的半三明治型芳基釕配合物由于其特殊的分子構型及其在抗癌研究中的作用，也引起了越來越多的關注。如Sadler課題組報道的[(η6-bip)Ru(en)Cl]PF6(en=乙二胺)表現出優異的腫瘤細胞抑制活性[7-8]，Dyson 課 題組 報道 的[(η6-cymene)Ru(PTA)Cl2](PTA=1，3，5-三氮雜-7-磷金剛烷)則表現出良好的抗轉移活性[9-10]。在這些配合物中，配體X、Y和Z的性質和結構對配合物的抗癌活性起著至關重要的作用[11-16]。

作為一類β-二酮配體，姜黃素及其衍生物(curcuminoids，Curc)以其抗炎、抗菌和抗腫瘤等廣譜的生物活性而受到人們的廣泛關注[17]。Caruso課題組報道了系列含類姜黃素配體的芳基釕配合物[(η6-cymene)Ru(Curc)Cl]，并發現這些配合物對腫瘤細胞有很好的抑制活性[18]。Dyson課題組在芳基釕-類姜黃素配合物中引入PTA配體，獲得了具有良好抗癌選擇性的芳基釕配合物[(η6-cymene)Ru(Curc)(PTA)]PF6[19]。此外，類姜黃素及金屬配合物的光譜和光化學性質具有一個重要特性：在波長為410～430 nm的光譜有強烈的吸收[20]。這一特性使得此類化合物具備光敏性，可利用光照來增強其抗癌活性[21]。Kondaiah課題組報道了含姜黃素配體的鉑配合物[Pt(Curc)(NH3)2]NO3，其在光照下細胞毒性比避光條件下提高13倍[22]。Renfrew課題組報道了一系列可在有氧和無氧環境下激活的含姜黃素配體的鈷配合物，其細胞光毒性比避光條件下提高20倍[23]。為了延續本課題組先前對芳基釕-類姜黃素配合物的探索，我們合成了3種新型的芳基釕-類姜黃素-PTA配合物[24]，通過核磁共振、質譜、單晶衍射等方法表征了它們的結構，通過MTT法研究其抗癌活性，并利用光照對其細胞光毒性進行了研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

實驗所用溶劑均采用國產分析純試劑并在使用前進行純化。[(p-cymene)RuCl2]2和其他試劑購自百靈威試劑公司,類姜黃素配體(L1～L3)均通過文獻方法制備[24]。1H NMR采用Bruker AV-600(德國)核磁共振波譜儀以600 MHz的頻率測定；HR-ESI-MS使用Waters UPLC XEVO G2 TOF質譜儀測定；C、H、N元素分析使用Elementar Vario EL Cube元素分析儀測定；UV-Vis使用Cary 100紫外可見分光光度計(澳大利亞安捷倫科技有限公司)測定；熒光光譜使用Thermo熒光光譜儀(美國)測定；單晶結構使用Bruker SMART CCD X射線單晶衍射儀測定。

1.2 配合物1～3的合成

配合物1～3的合成過程如Scheme 1所示。

Scheme 1 Synthesis of complexes 1～3

1.2.1 配合物[(η6-p-cymene)Ru(L1)(PTA)]PF6(1)的合成

將[(η6-p-cymene)RuCl2]2(31 mg，0.05 mmol)、配體L1(27.6 mg，0.1 mmol)和NaOEt(10.2 mg，0.15 mmol)溶解在6 mL乙醇中。室溫攪拌2 h，加入AgPF6(25.7 mg，0.1 mmol)后繼續攪拌2 h。過濾以除去AgCl沉淀，在濾液中加入PTA(15.7 mg，0.1 mmol)，室溫攪拌24 h，析出暗紅色固體，通過CH2Cl2/正己烷重結晶進行進一步純化(50.0 mg，產率62%)。元素分析(%，括號 內為 按 C35H41F6N3O2P2Ru·1/4CH2Cl2計 算值)：C 50.94(50.77)，H 4.99(5.02)，N 5.04(5.04)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ7.685(d，J=6.0 Hz，4H)，7.477～7.425(m，8H)，6.903(d，J=16.2 Hz，2H)，6.133(dd，J=32.4，5.4 Hz，4H)，5.950(s，1H)，4.474(dd，J=28.8，12.6 Hz，6H)，4.138(s，6H)，2.690(dd，J=13.8，6.6 Hz，1H)，2.038(s，3H)，1.300(d，J=6.6 Hz，6H)。HR-ESI-MS(DMSO)：[1-PF6-]+m/z實測值(理論值)：668.199 8(668.199 0)。

1.2.2 [Ru(η6-p-cymene)(L2)(PTA)]PF6(2)的合成

合成步驟同1。產量56 mg，產率66%。元素分析(%,括號內為按C35H39F8N3O2P2Ru·H2O計算值)：C 48.55(48.50)，H 4.89(4.77)，N 4.99(4.85)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ7.766(dd，J=8.4，5.4 Hz，4H)，7.440(d，J=16.2 Hz，2H)，7.300(t，J=9.0 Hz，4H)，6.861(d，J=15.9 Hz，2H)，6.123(dd，J=28.8，5.4 Hz，4H)，5.903(s，1H)，4.447(q，J=26.4，12.6 Hz，6H)，4.128(s，6H)，2.683～2.637(m，1H)，2.028(s，3H)，1.289(d，J=6.6 Hz，6H)。HR-ESI-MS(DMSO)：[1-PF6-]+m/z實測值(理論值)：704.179 6(704.180 1)。

1.2.3 [Ru(η6-p-cymene)(L3)(PTA)]PF6(3)的合成

合成步驟同1。產量43 mg，產率49%。元素分析(%,括號內為按C37H45F6N3O4P2Ru·5/4H2O計算值)：C 49.50(49.64)，H 5.10(5.35)，N 4.92(4.69)，1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ7.631(d，J=6.4 Hz，4H)，7.409(d，J=15.6 Hz，2H)，7.016(d，J=9.0 Hz，4H)，6.742(d，J=15.6 Hz，2H)，6.133(dd，J=34.2，5.4 Hz，4H)，5.845(s，1H)，4.440(q，J=22.8，12.6 Hz，6H)，4.120(s，6H)，3.819(s，6H)，2.687～2.641(m，1H)，2.030(s，3H)，1.293(d，J=6.6 Hz，6H)。HR-ESI-MS(DMSO)：[1-PF6-]+m/z實測值(理論值)：728.220 1(728.220 2)。

1.3 結構測定

配合物1～3的單晶測試是在293 K下用石墨單色化MoKα射線(λ=0.071 073 nm)于單晶衍射儀上，進行衍射點數據收集。利用直接法解出結構，并混合加氫，氫原子采用各向同性熱參數。非氫原子采用各向異性熱參數。結構經全矩陣最小二乘法修正，用SHELXL2016[25-26]和OLEX.2程序包分別進行晶體結構解析和結構修正。配合物1～3的單晶結構數據見表1，配合物1～3的部分鍵長、鍵角數據見表2。

表1 配合物1～3的晶體數據Table 1 Crystal data collection for 1～3

續表1

表2 配合物1～3的鍵長(nm)和鍵角(°)Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)in complexes 1～3

CCDC：1514601，1；1514600，2；1514603，3。

1.4 配合物的抗癌活性

本研究所使用的人肝癌細胞(HepG2)來自廣西醫科大學實驗中心。細胞在含10%的血清培養基RPMI-1640中生長。用MTT法測定配合物對癌細胞體外抗增殖活性：取對數期生長的癌細胞，配成細胞懸液，加入 96 孔板，每孔(200 μL)1×104～3×104個細胞，置培養箱內培養24 h;采用MTT法，每孔加入1 μL不同濃度的藥物，控制藥物終濃度分別為10、20、30、50、60、80 μmol·L-1，在培養箱中培養4 h后，癌細胞在λ＞400 nm，功率密度為30 mW·cm-2的條件光照30 min，繼續在培養箱中培養24 h。每孔加入20 μL(5 mg·mL-1)MTT，再置于培養箱中培養4 h，吸掉上清液，每孔加入100 μL的DMSO，置于搖床上低速震蕩，10 min后使用酶標儀上測量492 nm波長處OD值。每種藥物重復3次實驗，每次做3個復孔。計算配合物對癌細胞的IC50值。

2 結果與討論

2.1 合成與表征

配合物1～3均采用相同的方法合成：在室溫下將[(η6-p-cymene)RuCl2]2與相應的類姜黃素配體反應后，加入AgPF6除去Cl-，再加入PTA進一步反應合成得到。用核磁共振波譜、高分辨質譜、元素分析等手段對1～3進行了表征。其中，高分辨質譜實驗測得配合物1～3的m/z峰值分別為668.199 8、704.179 6和728.220 1，相對應的正離子分別為[(η6-p-cymene)Ru(L1)(PTA)]+、[(η6-p-cymene)Ru(L2)(PTA)]+和[(η6-p-cymene)Ru(L3)(PTA)]+，與配合物1～3的陽離子相吻合。

將配合物1～3配成濃度為20 μmol·L-1的DMSO溶液，研究其UV-Vis光譜。從圖1可以看到，這些配合物在310～510 nm區域有明顯的吸收，該吸收峰主要歸因于配體以及金屬-配體電荷轉移(1MLCT)[27]。配合物1和2的吸收光譜相似，其最大吸收峰位于375 nm，配合物3的最大吸收峰位于411 nm，相對于1和2明顯紅移。這是由于配體L3端位上的供電子基團OCH3導致。

圖1 配合物1～3在DMSO中的紫外可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra for complexes 1～3 in DMSO

2.2 配合物的晶體結構

配合物1～3的單晶結構如圖2～4所示。配合物1和2屬于單斜晶系的C2/c空間群，配合物3的晶體屬于三斜晶系P1空間群。3個配合物具有相似結構，其中心金屬釕（Ⅱ）離子與甲基異丙基苯配體中的苯環以η6形式配位，與類姜黃素配體以O，O螯合配位，與PTA配體中的P原子以單齒配位，形成六配位八面體結構的一價陽離子。甲基異丙基苯配體中的苯環中心與釕離子之間的距離分別為0.170 71(9)、0.173 31(8)、0.170 95(3)nm。另外 3個配位鍵鍵 長 為 Ru1—P1 0.231 7～0.232 6 nm、Ru1—O1 0.205 6～0.206 7 nm、Ru1—O2 0.207 0～0.207 6 nm，表明3個配合物的結構非常相似。C1—C2和C1—C2′的鍵長在0.140 8～0.150 0 nm范圍，該長度處于單鍵鍵長和雙鍵鍵長之間，這是由配體中β-二酮的部分形成去質子化螯合配體后主要以(—O—C—C—O—)形式共振而導致。圍繞金屬釕離子的鍵角為 O1—Ru1—O2 87.83°～88.76°、O1—Ru1—P1 85.77°～86.71°、O2—Ru1—P1 85.95°～86.06°，與之前報道的類似配合物數值接近[24]。

圖2 配合物1的30%概率橢球晶體圖Fig.2 ORTEP of 1 with thermal ellipsoids probabilityof 30%

圖3 配合物2的30%概率橢球晶體圖Fig.3 ORTEP of 2 with thermal ellipsoids probability of 30%

圖4 配合物3的30%概率橢球晶體圖Fig.4 ORTEP of 3 with thermal ellipsoids probability of 30%

2.3 配合物的細胞活性測試

類姜黃素-芳基釕配合物1～3對HepG2人肝癌細胞的體外抗腫瘤活性見表3。結果顯示，在避光條件下，配合物1和2對HepG2細胞均未表現出抗腫瘤活性，配合物3對HepG2細胞表現出一定抗腫瘤活性，IC50值為(60.3±1.1)μmol·L-1。顯然，相對于吸電子基團(配合物1和2中的H和F原子)，類姜黃素配體端位的供電子基團(配合物3中的—OCH3)對此類配合物的HepG2細胞增殖抑制活性影響更為正面。使用λ＞400 nm的光照射30 min后，配合物1仍未顯示出抗腫瘤活性，但配合物2和3對HepG2細胞的增殖抑制活性得到明顯提高，其IC50值分別降低 為 (60.1±1.0) μmol·L-1和 (45.0±6.1) μmol·L-1。這說明利用光照作用，可以有效提高類姜黃素-芳基釕配合物的抗腫瘤活性，這可能是由于配合物在光照后產生活性氧[22]，從而提高了配合物的細胞毒性。因此，雖然這3個配合物對HepG2細胞的增殖抑制活性較為溫和，但是本研究對于此類配合物的構效關系研究和提高其使用效率具有一定的參考價值。

表3 配合物1～3對人肝癌細胞(HepG2)的IC50值(λ＞400 nm)Table 3 IC50values(λ＞400 nm)of 1～3 against HepG2 cancer cell lines

3 結論

設計、合成了3種新型類姜黃素-芳基釕配合物1～3。并通過單晶X射線衍射實驗，對比研究了這3個配合物的結構。在避光條件下，配合物1和2對HepG2人肝癌細胞不顯活性，而配合物3表現出一定的活性，原因可能是相對于吸電子基團的H原子和F原子，類姜黃素配體端位苯環上的供電子基團—OCH3更有利于配合物對HepG2細胞的增殖抑制活性。光照后(λ＞400 nm)，除配合物1外，2和3對HepG2細胞的增殖抑制活性都有明顯提高，說明光照可以有效提高此類配合物的抗腫瘤活性。本研究為進一步設計合成新型高效抗癌芳基配合物提供了一定的理論基礎。