以9-蒽醛為熒光基團的吡唑啉衍生物熒光探針對Fe3+和Cu2+的檢測

羅杰偉 趙 波 張仕祿 賈飛云 劉 軍

(川北醫學院基礎醫學院，南充 637000)

到目前為止，許多測量技術如原子吸收光譜法、核磁共振分光光度法和熒光技術等已經被廣泛用于生物遺傳、藥物控制釋放、工業傳感和環境監測等領域。其中，熒光化學傳感器以其靈敏度高、響應速度快、檢出限低、實時監測等優點引起了研究者的極大興趣[1-8]。在重金屬離子中，Fe3+和Cu2+是生物系統內最重要的微量元素，參與了細胞水平上的許多生物和化學過程，如載氧活性、細胞代謝、酶促反應和各種生物合成等，但是體內Fe3+和Cu2+過多卻會給人的身體健康帶來傷害[9-10]。如Fe3+過多或缺乏可能導致免疫力低下、智力降低和抗感染能力降低，甚至誘發各種疾病等[11]。過量的Cu2+會在肝臟和腦組織內積聚，從而引起肝硬化和腹水等疾病，甚至會發生肝昏迷而死亡，也會導致語言不清、呆笑等病癥[12]。此外，在工業或者生活污水中的鐵、銅含量過高會造成嚴重的環境污染。因此，Fe3+/Cu2+對環境的污染和人體健康的危害日益受到了人們的廣泛關注。但開發高靈敏度、高選擇性的熒光化學傳感器應用于生物和環境系統監測Fe3+/Cu2+仍然是一個巨大的挑戰[13-16]。

吡唑啉衍生物是一類重要的五元含氮雜環化合物，在醫藥和農藥等方面有著優良的生物活性和重要應用，它們具有抗病毒、消炎、殺滅真菌、抗菌以及抗癌等廣泛生物活性[17-19]。吡唑啉環1位上N原子是分子作為電荷轉移的電子供給源，而與3位上碳原子的相鄰處則為電子接收部位，1、3位連有芳基時可構成較大的π共軛體系。此外，吡唑啉環中2個氮原子的電子云密度較高，可作為電子給體，易于與電子受體化合物發生電子轉移。吡唑啉衍生物因分子內存在大π共軛體系而具有良好的光學性質，可通過熒光光譜法檢測各種金屬離子[20-21]。因此，研究者通過在吡唑啉環上引入不同官能團改變分子內電子轉移的機制，從而豐富其分子結構和拓寬其在離子識別方面的應用，但目前關于吡唑啉衍生物同時選擇性識別Cu2+和Fe3+的報道還很少[22-25]。鑒于此，我們課題組合成了一種熒光分子探針 1，5-二苯基-3-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)吡唑啉(PMAP)，研究了探針PMAP的離子識別性能,測定了PMAP在Fe3+、Cu2+和H+不同組合條件下的量子產率,考察了PMAP在實際水樣中檢測Cu2+和Fe3+的效果。結果表明，熒光傳感器PMAP可在環境監測和工業傳感等領域通過儀器和裸眼監測和檢測Fe3+/Cu2+。PMAP合成路線如Scheme 1所示。

Scheme 1 Synthesis route of compound PMAP

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

實驗所用試劑均為市售分析純試劑；金屬離子溶液所用金屬鹽均為高氯酸鹽水合物；實驗用水為二次蒸餾水；溶劑均以標準方法處理。所用儀器有：Bruker 400MHz核磁共振儀(TMS為內標，CDC13為溶劑)、XT-4型雙目顯微熔點測定儀(溫度計未校正)、CaryEclipse熒光分光光度計(美國VARIAN公司)、UV2550型紫外分光光度計(日本島津公司)、pHS-3C型酸度計、Bruker SMART 1000 CCD(德國Bruker公司)。

1.2 合 成

1.2.1 化合物1和化合物2的合成

參考文獻[26]方法合成9-羥甲基蒽(1)和9-溴甲基蒽(2)，其熔點分別為161～162 ℃和126～128 ℃(文獻值[26]：161～162 ℃和126～128 ℃)。

1.2.2 9-蒽甲基嗎啉(3)的合成在250 mL圓底燒瓶中加入2(5 g，18.45 mmol)、無水K2CO3(7.65 g，55 mmol)、80 mL 無水 CH3CN 和少量KI，攪拌回流9 h。冷卻至室溫，抽濾，旋轉蒸發出溶劑，用二氯甲烷和石油醚重結晶得到黃色顆粒狀固體 4.1 g，產率 80.4%。m.p.143～144 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃ )：δ2.61～2.64(t，J=4.6 Hz，4H，—N—CH2—)，3.64～3.66(t，J=4.6 Hz，4H，—O—CH2—)，4.46(s，2H，Ar—CH2—)，7.46～7.56(m，4H，Ar—H)，8.00～8.03(m，2H，Ar—H)，8.44(s，1H，Ar—H)，8.48～8.49(d，J=4 Hz，1H，Ar—H)，8.51(s，1H，Ar—H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ53.65，54.54，67.11，76.77，77.09，77.41，124.84，124.99，125.63，127.55，128.96，129.10，131.35，131.39。

1.2.3 1-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)乙酮(4)的合成

250 mL三頸瓶中加入 3(1 g，3.6 mmol)、乙酰氯(1.7 g，22 mmol)和50 mL無水二氯甲烷，在冰鹽浴下攪拌，溫度冷卻至-5～0℃時，分批加入0.96 g無水三氯化鋁，拆去冰浴，攪拌至溫度升到10℃。抽濾，無水二氯甲烷洗滌，粗產品緩慢加入150 mL冰和濃鹽酸的混合溶液中，用二氯甲烷和水萃取，飽和Na2CO3溶液洗至pH=7，無水MgSO4干燥，抽濾，旋轉蒸發出溶劑,經柱層析純化(石油醚/二氯甲烷，4∶1，V/V)得黃色固體0.35 g，產率30%。m.p.158～160℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ2.60～2.62(t，J=4.4 Hz，4H，—N—CH2—)，2.77(s，3H，—COCH3)，3.63～3.65(t，J=4.4 Hz，4H，—O—CH2—)，4.44(s，2H，Ar—CH2—)，7.51～7.63(m，2H，Ar—H)，8.03～8.07(m，2H，Ar—H)，8.49～8.53(m，2H，Ar—H)，8.58(s，1H，Ar—H)，8.64～8.65(d，J=4 Hz，1H，Ar—H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ26.44，53.52，54.42，66.97，122.86，124.99,125.44,125.58,126.91,129.17，130.06，131.69，132.23，132.90，133.37。

1.2.4 1-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)-3-苯基丙基-2-烯-1-酮(5)的合成

2.嫖宿行為的構成，除了自然性交外，口交、手淫、肛交等也可構成，而奸淫行為的構成，只限于自然性交。這就意味著，在目前的情況下，強奸罪已無法容納“嫖宿”行為，嫖宿幼女罪難以“并入”強奸罪。

100 mL圓底燒瓶中加入7 g KOH、10 mL水、50 mL 95%乙醇，冷卻至室溫，加入4(0.638 g，2 mmol)、苯甲醛(0.318 g，3 mmol)，在15 ℃攪拌3 h。過濾，水洗，無水乙醇重結晶得黃色固體0.51 g，產率62.7%。m.p.140～142 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ2.61～2.64(t，J=4.4 Hz，4H)，3.64～3.66(t，J=4.4Hz，4H),4.46(s,2H),7.46～7.47(m，3H)，7.53～7.55(m，1H)，7.59～7.63(m,1H)，7.72～7.75(m，3H)，7.90～7.94(d，J=16 Hz，1H)，8.05～8.07(m，1H)，8.11～8.12(m，1H)，8.50～8.52(m，1H)，8.56～8.58(d，J=8 Hz，1H)，8.61(s，1H)，8.725～8.73(d，J=1.92 Hz，1H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ53.55，54.45，66.99，121.75，123.52，125.02，125.43，125.82,126.90,128.42,128.92,129.19，130.10，130.13，130.49,131.71,131.88,132.27,132.88，134.39，134.90，144.58。

1.2.5 1，5-二苯基-3-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)吡唑啉(PMAP)的合成

50 mL 圓底燒瓶中加入 5(0.5 g，1.2 mmol)、10 mL無水乙醇，加熱至溶解。加入苯肼(0.199 g，1.18 mmol)和一粒氫氧化鈉，回流16 h。冷卻，加適量水，析出黃色固體，抽濾，水洗，無水乙醇重結晶得0.21 g，產率35%。m.p.266～267 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ2.61～2.64(t，J=4.6 Hz，4H，—N—CH2—)，3.33～3.35(d，J=8 Hz，1H)，3.64～3.66(t，J=4.6 Hz，4H，—O—CH2—)，3.99～4.01(d，J=8 Hz，1H)，4.44(s，2H，Ar—CH2)，5.36～5.38(d，J=8 Hz，1H)，6.80～6.84(m，1H，Ar—H)，7.14～7.16(t，J=8.46 Hz，2H，Ar—H)，7.20～7.24(m，2H，Ar—H)，7.27～7.30(m，2H，Ar—H)，7.36～7.37(t，J=4.08 Hz，3H，Ar—H)，7.46～7.50(m，1H，Ar—H)，7.512～7.514(m，1H，Ar—H)，7.83～7.84(d，J=4 Hz，1H，Ar—H)，7.96～7.98(d，J=8 Hz，1H，Ar—H)，8.26～8.29(m，1H，Ar—H)，8.34(s，1H，Ar—H)，8.46～8.49(m，2H，Ar—H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ43.13，53.56，54.44，64.47，67.06，76.63，76.94，77.26，113.39，119.20，123.36，125.02，125.20，125.71,125.78,127.54,127.67,128.82，128.88，129.10，129.36,130.97,131.10,131.65,131.74，142.44，144.48，146.47。

1.3 光譜實驗

稱量0.004 7 g(0.01 mmol)PMAP于100 mL容量瓶中，以乙腈為溶劑配成濃度為0.1 mmol·L-1的溶液。配制濃度為0.1 mmol·L-1的 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ag+、Fe3+、Ni2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Zn2+、Hg2+等離子的高氯酸鹽溶液。移取0.1 mL PMAP溶液和0.1 mL金屬陽離子溶液分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至10 mL，搖勻，靜置24 h。室溫下，以乙腈為參比，在波長為200～900 nm條件下測定混合溶液的紫外可見吸收強度；在激發波長為360 nm和狹縫寬度d=5 nm的條件下測定熒光強度。

1.4 晶體結構檢測

將PMAP溶于乙腈溶液，利用乙醚揮發性析出PMAP單晶，選取合適晶體用于單晶結構測試。用Bruker SMART 1000 CCD衍射儀，選擇石墨單色器單色化的MoKα射線(λ=0.710 73 nm)，在296 K下收集衍射數據。利用SAINT5.0和SHEIXTL-97[27]程序完成化合物的數據還原和數據解析。采用全矩陣最小二乘法對晶體結構進行直接法解析。氫原子坐標經差值Fourier合成得到，非氫原子坐標由直接法得到。氫原子采用各向同性熱參數修正，其它原子采用各向異性熱參數修正[28-29]?；衔颬MAP的晶體學參數列于表1。

CCDC：2051694。

表1 PMAP的晶體學參數Table 1 Crystal data and structure refinement for PMAP

2 結果與討論

2.1 PMAP的晶體結構

在探針PMAP的晶體結構中，C1～C6平面和吡唑啉環近似共平面(二面角為0.62°)，C8～C13平面與吡唑啉環夾角為88.6°，C8～C13幾乎垂直這2個平面。而嗎啉環與蒽環和吡唑啉環之間夾角分別為73.48°和67.8°(圖1a)。相鄰分子之間依靠C—H…N氫鍵和C—H…O氫鍵以及苯環平面之間π…π堆積作用自組裝成有序的超分子結構(圖1b)。

圖1 (a)PMAP的30%橢球概率晶體結構圖;(b)PMAP的晶體堆積圖Fig.1 (a)Molecular structure of PMAP with probability level of 30%;(b)Crystal packing of PMAP

2.2 光譜分析

如圖2a顯示，加入Fe3+，PMAP的紫外可見吸收光譜在267和380 nm的吸光度分別從1.26、0.74上升到2.24和1.1，在610 nm出現新吸收峰，吸光度為0.27；加入Cu2+后，267 nm處的吸光度從1.26升至1.6；380 nm處從0.74降至0.3，610 nm出現峰值為0.23的新吸收峰，其它離子沒有變化。圖2b表明，加入Fe3+和Cu2+后，PMAP熒光強度分別在577和532 nm處發生明顯猝滅，其中，加入Fe3+時發生約45 nm紅移，其它離子對PMAP的熒光強度無影響?？赡苁荈e3+和Cu2+的軟硬酸堿配位作用導致熒光猝滅，具有“on-off”開關性能。另外，加入Fe3+和Cu2+后，溶液顏色從淡黃色變為藍色(圖3)，其他離子加入后溶液顏色沒有變化，即裸眼可判斷探針PMAP選擇性識別Fe3+和Cu2+。

圖2 加入不同離子后PMAP在乙腈水溶液中紫外可見吸收光譜(a)和熒光光譜(b)Fig.2 UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of PMAP with various cations

圖3 加入不同離子后PMAP溶液顏色變化Fig.3 Color changes of PMAP after addition of various ions

2.2.2 紫外可見滴定和熒光滴定

鑒于PMAP對Fe3+和Cu2+具有較好識別，利用Fe3+/Cu2+對PMAP進行紫外可見滴定和熒光滴定。在Fe3+對PMAP紫外可見滴定中，267、380和610 nm處各個峰吸光度增強(圖4a)。在360 nm的激發波長下，在 0～1.0 μmol·L-1范圍內的熒光滴定實驗中，隨著Fe3+濃度增大，PMAP熒光強度從660降至193，最大峰位向長波方向移動，從532 nm移到567 nm(圖4b)。紅移原因可能是吡啶環上N原子參與了配位，熒光猝滅被抑制。同樣，在Cu2+對PMAP的紫外可見滴定中，380 nm處峰值不斷下降，在267和610 nm處強度逐漸增大，但變化程度較小(圖5a)。隨著Cu2+濃度的增大，PMAP在532 nm的熒光強度從937逐漸降低到0，同時在425 nm出現了一個熒光強度逐漸增大的新峰，強度從0到189(圖5b)。Job曲線圖顯示探針PMAP與Fe3+/Cu2+配位比為1∶1，可能是PMAP能提供一個合適的空間來容納Fe3+/Cu2+。

圖4 加入不同濃度Fe3+后PMAP的紫外可見吸收光譜(a)和熒光光譜(b)Fig.4 UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of PMAP after addition of Fe3+with various concentrations

圖5 加入不同濃度Cu2+后PMAP的紫外可見吸收光譜(a)和熒光光譜(b)Fig.5 UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of PMAP after addition of Cu2+with various concentration

2.2.3 抗酸性研究

如圖6a所示，在H+對PMAP的紫外可見滴定中，在380 nm處，當pH=1～4時，峰值隨pH值的增大而增大，但pH=4～7時，峰值變化較??；在610 nm處，pH=1時，強度明顯降低，但pH≥2時，強度變化不大。熒光滴定發現，當pH=5～7時，熒光強度基本不變；pH≤4時，熒光強度突然驟降并紅移；pH=1時，熒光完全猝滅(圖6b)，說明嗎啉環上的O原子、N原子以及吡啶環上的N原子容易質子化。結果表明，PMAP傳感器檢測Fe3+/Cu2+的pH值范圍為5～7。

圖6 pH值對PMAP紫外可見吸收光譜(a)和熒光光譜(b)的影響Fig.6 Effect of pH value on UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of PMAP

2.2.4 配位干擾實驗

為了排除其他離子干擾，研究了Fe3+、Cu2+與其他金屬離子共存時，探針PMAP在532 nm處的熒光變化情況。結果證實，分別加入堿金屬和堿土金屬如 K+、Na+、Hg2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+和過渡金屬如 Cd2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+后，PMAP對Fe3+和Cu2+的響應基本不受影響(圖7)，說明PMAP對Fe3+和Cu2+有良好的選擇性識別。

圖7 在PMAP、Fe3+和Cu2+共存時加入金屬離子后熒光強度變化Fig.7 Effect of coexisting ions on fluorescence intensity of the solution containing PMAP,Fe3+,Cu2+

2.3 量子產率測定

在探針 PMAP 的乙腈溶液(10 μmol·L-1)中分別加 入 Cu2+(20 μmol·L-1)、Fe3+(20 μmol·L-1)和 H+(20 μmol·L-1)，在激發波長為360 nm下測其熒光強度。以蒽(1.0 μmol·L-1)為參比(室溫，Φf=0.36)，運用公式Yu=YsIuAs/(IsAu)計算量子產率(表 2)，其中Yu為待測物質量子產率，Ys為標準物質量子產率，Is為蒽的熒光積分強度，As為在360 nm時紫外可見吸光度，Iu和Au分別為化合物PMAP熒光積分強度和紫外可見吸光度。

表2 PMAP的乙腈溶液(1.0 μmol·L-1)中加入Fe3+、Cu2+、H+不同組合時的熒光量子產率Table 2 Fluorescence quantum yield of PMAP(1.0 μmol·L-1)upon addition of different combinations of Fe3+,Cu2+,H+in acetonitrile

2.4 分子邏輯門

分子邏輯門是在分子水平上的邏輯操作來描述邏輯門、輸入和輸出信號，可通過改變離子性質、滴加順序或者激發波長獲得不同的熒光發射波長和熒光強度。由于Fe3+和Cu2+加入后探針PMAP熒光強度減弱以及pH＜4時PMAP熒光強度降低，考察了PMAP中滴加Fe3+、Cu2+和H+不同組合時的熒光強度變化。圖8顯示，Cu2+、Fe3+、H+以不同組合加入到PMAP中會產生不同的熒光輸出信號，PMAP滿足三輸入NOR邏輯門條件，可構建出NOR分子邏輯門以及分子熒光開關等運算與控制單元。

圖8 PMAP溶液中加入Fe3+、Cu2+和H+不同組合時的熒光強度變化Fig.8 Fluorescence intensity of PMAP upon addition of different combinations of Cu2+,Fe3+and H+

依據上述體系熒光性質，以PMAP的乙腈溶液為起始狀態，熒光輸入信號Input1、Input2和Input3分別為Cu2+、Fe3+和H+，將其設計成一個NOR分子邏輯門，真值表列于表3。結合表2中量子產率，規定邏輯門閥值為0.1，量子產率大于0.1設定為輸出信息號1，量子產率小于0.1設定輸出信號為0。如表3所示，只有輸入信號為(0，0，0)時，體系有強熒光，量子產率大于0.1，體系輸出信號為1；其他7種輸入信號為(1，0，0)、(0，1，0)、(0，0，1)、(1，0，1)、(0，1，1)、(1，1，0)、(1，1，1)時，體系有弱熒光，量子產率小于0.1，輸出信號均為0，說明該體系是一個典型的NOR邏輯系統(圖 9)。

圖9 PMAP的NOR邏輯門循環示意圖Fig.9 Circulation diagram of NOR logic gate for PMAP

表3 PMAP的NOR邏輯門真值表Table 3 Truth table of NOR logic gate for PMAP

2.5 識別機理探討

根據相關文獻[30-32],探針PMAP能較好地選擇性識別 Fe3+、Cu2+并形成 1∶1型穩定的配合物,可能是PMAP環上氮原子和氧原子中孤對電子發生躍遷，與Fe3+、Cu2+上d軌道形成d-π型配合物(Scheme 2)。根據Schellhamr的經驗，在吡唑啉基的1位、3位和5位引入苯基等助色基團可增加其熒光性；Fe3+、Cu2+的引入也可能受芳環上π電子的作用，增強了主體對客體的包結能力，這對識別Fe3+、Cu2+可能也起了一定的作用。而根據軟硬酸堿理論，PMAP環上雜原子作為軟給體原子與軟金屬銅、鐵有強的親和力也是主體識別Fe3+和Cu2+的動力之一。因此，PMAP在環上雜原子的配位作用及芳環上π電子等弱非共價鍵的協同作用下能夠較好地識別Fe3+和Cu2+。

Scheme 2 Proposed recognition mechanism of Fe3+(a)and Cu2+(b)by PMAP

2.6 水樣檢測

為了進一步探索傳感器在實際水樣中的應用潛力，采集了南充市嘉陵江水和自來水2種實際水樣，并進行了膜預處理以去除懸浮物，然后分別在實際水樣中加入不同量的Cu2+和Fe3+，計算其回收率。結果如表4和表5所示，PMAP對Cu2+的重現率為99.4%～103.2%，對Fe3+的重現率為98.3%～102.3%，表明PMAP對實際水樣中Cu2+和Fe3+的測定具有較高的準確度和一定的應用前景。

表4 在實際樣品中檢測Cu2+Table 4 Application in practical samples for detection of Cu2+

表5 在實際樣品中檢測Fe3+Table 5 Application in practical samples for detection of Fe3+

3 結論

合成了一種新型熒光探針1，5-二苯基-3-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)吡唑啉(PMAP)，利用紫外可見吸收光譜和熒光發射光譜考察其對金屬離子的識別性能。探針PMAP對Fe3+、Cu2+具有良好的識別效果，熒光量子產率分別從0.14降到0.05和0.04，溶液顏色從淡黃色變為藍色，其中加入Fe3+時紅移約45 nm。PMAP與Fe3+/Cu2+以1∶1的化學計量比形成配合物，檢測限約為 1 μmol·L-1。通過調控 Fe3+、Cu2+和H+輸入信號使PMAP熒光猝滅，在分子水平構建了簡單而有效的NOR邏輯電路。另外，在實際樣品中的應用表明，PMAP可有效地用于實際水樣中Cu2+和Fe3+的檢測。因此，熒光傳感器PMAP可通過儀器和裸眼在環境監測和工業傳感等領域監測和檢測Fe3+/Cu2+。

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