基于PubMLST數據庫分析蠟樣芽胞桿菌群的遺傳學

萬 經，趙 煒，崔 穎，毛 展，周幗萍*

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.南通海關，江蘇 南通 226006）

蠟樣芽胞桿菌群（Bacillus cereus group）為革蘭氏陽性菌[1-2]，廣泛分布于土壤等環境中。其中含有12個同源性很高的種，包括常見的食品污染菌和條件致病菌蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus，Bc）、昆蟲病原菌蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）、人畜病原菌炭疽芽胞桿菌（Bacillus anthracis，Ba）、具有獨特真菌樣大而卷發樣菌落形態的蕈狀芽胞桿菌（Bacillusmycoides，Bm）和假蕈狀芽胞桿菌（Bacillus pseudomycoides，Bpm）以及韋氏芽胞桿菌（Bacillus weihenstephanensis，Bw）[3]；2010年后又添加了耐高溫具有細胞毒性的Bacillus cytotoxicus[4]、用于動物營養的益生菌Bacillus toyonensis[5]、乳品中分離的耐低溫具有細胞毒性腐敗菌的維德曼芽胞桿菌（Bacillus wiedmannii）[6]、環境中分離的兵馬俑芽胞桿菌（Bacillusbingmayongens is）、大山芽胞桿菌（Bacillus gaemokensis）和Bacillus manliponensis6個新種[7-9]。該群內各種在分子水平上基因組同源性極高，其表型和致病性的差別主要由可移動遺傳因子—質粒所決定，然而質?？梢詠G失、消除和結合轉移，導致其種之間分類界定爭議較大[10-11]。蠟樣芽胞桿菌是我國常見的食源性條件致病菌，蘇云金芽胞桿菌在農業上多用于生物農藥，炭疽芽胞桿菌是人畜共感染并且具有高致死率，各自具有重要的研究價值，如何有效區分它們有重要研究價值。

蠟樣芽胞桿菌群中12個種在常規的16S rRNA序列分析中具有99%～100%相似性，無法進行種間區分[12]。多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，Bacillus cereus PubMLST數據庫選取了glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA和tpi共7個常見管家基因片段進行測序，該法準確度高、重現性好，便于全球不同實驗室的數據比對分析[13]。目前PubMLST數據庫中已有50多個國家2 453條菌株的信息，是蠟樣芽胞桿菌群信息最豐富、準確的全球數據平臺。

Mega是生成系統進化樹較常用的軟件，可用于分析來自物種或種群的DNA和蛋白質序列數據[14]；Phyloviz軟件是適合PubMLST數據庫配套使用的可結合序列型和菌株基本信息進行多維度聚類分析的軟件[15]；IQ-tree是2014年基于最大似然（maximum likelihood，ML）法推出的建樹軟件，具有準確、快速、靈活等特點，特別適用于大數據的系統發育分析[16-17]。ModelFinder是快速、精確的基于模式選擇法的系統發育的算法?；谠摯髷祿脚_，本研究以Bacillus cereus PubMLST數據庫為數據來源，采用常用的分子進化遺傳軟件Mega，以及更適合大數據分析的Phyloviz和IQ-tree軟件分析探討Bc群內不同種之間的系統進化關系。

1 材料與方法

1.1 軟件

進化樹軟件MEGA 6.06、IQ-tree、Phyloviz 1.1。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株信息的搜集

Bacillus cereus PubMLST數據庫[18]中共有來自于全球50多個國家蠟樣芽胞桿菌群的2 453條數據，從中篩選出具有完整序列信息的蠟樣芽胞桿菌群菌株的信息。目前，Bacillus cereus PubMLST數據庫中尚未包含2010年及其之后發表的6個新種信息。

1.2.2 鄰接法系統發育樹分析

采用MEGA 6.06軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統進化樹。

1.2.3 最小生成樹分析

采用Phyloviz1.1軟件[19-20]對Bacillus cereus PubMLST數據的來源、國別、致病性、序列型（sequence type，ST）[21]進行統計，計算得出各自在全體數據的數量、總體中的比例，并作出相應可視化圖片、表格等。運用goeBURST Full最小生成樹（minimum spanning tree，MST）[22]中的距離算法作出蠟樣芽胞桿菌群的MST，通過數據組信息中的ST編號與菌株詳細信息關聯，對MST中的編號信息進行關聯分析。

1.2.4 ML法系統進化樹分析

采用MAFFT v5[23-24]對所有序列進行比對，基于Linux系統運行的IQ-Tree[25]進行核酸模型檢測，以ML法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 蠟樣芽胞桿菌群數據分析

從Bacillus cereus PubMLST數據庫中共篩選出1 329株有效數據，7個管家基因片段拼接后全長為2 829 bp[26]。包括蠟樣芽胞桿菌及其變種共計864株，占總數比為65.01%；蘇云金芽胞桿菌及其變種345株，占總數比為25.96%；炭疽芽胞桿菌共61株，占總數比為4.59%；韋氏芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、假蕈狀芽胞桿菌分別為33、21、5株，占總數比分別為2.48%、1.58%、0.37%。其中，全球五大洲數據及未注明地區數據的信息詳見表1。除未明確標出地區的326條數據外，亞洲、歐洲和北美洲的蠟樣芽胞桿菌菌群的菌株數明顯高于南美洲、非洲和大洋洲。

表1 蠟樣芽胞桿菌群在全球的分布Table 1 Global distribution of Bacillus cereus group

去除未明確標注分離來源的605株菌株信息，724株菌株的分離來源見圖1。由圖1可知，來源于土壤、奶制品、其他種類食品的菌株居多，也有來自環境和臨床樣本如病人的肺部組織、肝臟組織以及血液等的菌株。

圖1 蠟樣芽胞桿菌群分離源的分布Fig.1 Distribution of isolation sources of Bacillus cereus group

2.2 蠟樣芽胞桿菌群遺傳分析

2.2.1 蠟樣芽胞桿菌群最小生成樹分析

蠟樣芽胞桿菌群的最小生成樹見圖2。

圖2 蠟樣芽胞桿菌群的最小生成樹Fig.2 Minimum spanning tree of Bacillus cereus group

由圖2可知，蠟樣芽胞桿菌及其變種分布最為廣泛，散布于整個最小生成樹的各個分支上；蘇云金芽胞桿菌及其變種多數集中于左下部一支較大的進化分支上，少數菌株卻分散在其他所有進化分支上；而炭疽芽胞桿菌最集中，聚集在左下角進化分支的遠端，與其同在一分支上的近緣菌株有蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌；韋氏芽胞桿菌相對集中，并與部分蕈狀芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和少量蘇云金芽胞桿菌交織分布在同一進化分支上。

蕈狀芽胞桿菌和假蕈狀芽胞桿菌原為同一個種，具有大而粗糙發散的卷發樣菌落，與蠟樣芽胞桿菌群內其他種菌株在菌落、表型上差異顯著，后因脂肪酸組成差異而區分為兩個不同的種[27]。假蕈狀芽胞桿菌數量較少，在進化樹中分布相對集中，而蕈狀芽胞桿菌零散地分布在進化樹中多個分支上，與它們較為接近的菌株卻是蠟樣芽胞桿菌；耐低溫、菌落小而光滑的韋氏芽胞桿菌和部分蕈狀芽胞桿菌最為接近。

2.2.2 ML法蠟樣芽胞桿菌群的系統進化樹分析

7對管家基因經多基因聯合后采用ML法構建系統進化樹，結果見圖3。

圖3 蠟樣芽胞桿菌群7對管家基因聯合系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus cereus group based on 7 pairs of housekeeping genes

由圖3可知，系統進化樹的進化情況與MST的情況基本一致。炭疽芽胞桿菌、韋氏芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、假蕈狀芽胞桿菌在進化樹中的分布也相對比較集中，其中，炭疽芽胞桿菌在進化樹中的分布主要集中在一個進化分支上。韋氏芽胞桿菌和部分蕈狀芽胞桿菌集中在同一支上，兩者難于區分。

LIU Y等[28]采用多種生物信息學方法分析蠟樣芽胞桿菌群遺傳情況發現，采用pyc基因對GeneBank數據庫中224個蠟樣芽胞桿菌菌株的分型效果最好。因此，以Bacillus cereus PubMLST數據庫中菌株的pyc基因序列構建系統進化樹，結果見圖4。由圖4可知，pyc基因對蠟樣芽胞桿菌群的分型效果與圖3非常接近，可見pyc基因序列分型效果確實良好。

圖4 蠟樣芽胞桿菌群pyc基因系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus cereus group based on pyc gene

2.2.3 NJ法蠟樣芽胞桿菌群的系統進化樹分析

采用NJ法構建炭疽芽胞桿菌、部分蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌及其變種7對管家基因聯合的系統進化樹，結果見圖5。

圖5 炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌及其變種7對管家基因聯合系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of Bacillus anthracis,Bacillus cereus,Bacillus thuringiensis and its varieties based on 7 housekeeping genes

從圖5可以看出，在系統進化樹中炭疽芽胞桿菌的6個ST集中在同一個進化分支上，但ST552和ST553則在臨近并相對獨立的一個進化分支上，與部分蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌混雜在一起。其中ST552和ST553分離株來源于中國，從牛的血液中分離[29]，但尚未見到關于這兩個菌株的具體病理和毒性分析的深入報道，無法進一步判斷這兩株炭疽芽胞桿菌的特性，有研究顯示，除南極洲以外，所有大陸都有地方性炭疽病疫源地[30]。

炭疽芽胞桿菌、部分蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌及其變種的管家基因及部分ST見表2?，F今提交的炭疽芽胞桿菌的ST共有8個[26]：1、2、3、134、135、552、553、933。其核心型ST1分別與ST3、ST134、ST135和ST933僅有1對管家基因編號有差別，ST1與ST3的glp管家基因編號分別為1和2，兩者有1個堿基對差異；ST1與ST134的pta管家基因編號分別為1和57，兩者有1個堿基對差異；ST1與ST135的gmk管家基因編號分別為1和39，兩者有1個堿基對差異；ST1與ST933的glp管家基因編號分別為1和53，兩者有5個堿基對差異。ST1與ST2在ilv和pyc兩個管家基因編號存在差異，共有2個堿基差異。ST552和ST553均與核心型ST1有5個管家基因編號不同，且均共有54個堿基差異。而ST552與ST553兩者之間僅有1個管家基因編號不同，兩者有1個堿基對差異，但是和其他炭疽芽胞桿菌差別較大。炭疽芽胞桿菌甚至和部分Bc、Bt、Bt變種的更為相似，顯示出炭疽芽胞桿菌在總體上的高度保守性和部分分化，與圖2和圖3分析吻合。

表2 炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌及變種的管家基因及STTable 2 Housekeeping genes and ST of Bacillus anthracis,Bacillus cereus,Bacillus thuringiensis and its varieties

韋氏芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌與假蕈狀芽胞桿菌7對管家基因聯合的系統進化樹見圖6。由圖6可知，蕈狀芽胞桿菌ST445、ST696、ST970和假蕈狀芽胞桿菌集中在一個分支上，另兩個進化分支均為蕈狀芽胞桿菌和韋氏芽胞桿菌的混合分布，兩者的進化關系較接近，說明用7對管家基因聯合建系統發育樹的方式是很難將兩者分開的，韋氏芽胞桿菌與蕈狀芽胞桿菌在菌落形態上差異很大，兩者部分菌株卻有一定的親緣性。

圖6 韋氏芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌及假蕈狀芽胞桿菌7對管家基因聯合系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of Bacillus weihenstephanensis,Bacillus mycoides and Bacillus pseudomycoides based on 7 pairs of housekeeping genes

3 結論

該研究從Bacillus cereus PubMLST數據庫中篩選得到1 329株完整的蠟樣芽胞桿菌菌株信息，其中蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）及變種864株、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）及變種345株、炭疽芽胞桿菌（Bacillusanthracis）61株、韋氏芽胞桿菌（Bacillus weihenstephanensis）、蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides）、假蕈狀芽胞桿菌（Bacillus pseudomycoides）分別為33、21和5株。通過Phyloviz Mega和IQ-tree軟件研究蠟樣芽胞桿菌菌群的種群結構和進化關系發現，蠟樣芽胞桿菌菌群內占比很高的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌具有豐富而復雜的遺傳多樣性，相互交織地散布于群內幾乎所有的進化分支上，兩者無法區分；炭疽芽胞桿菌在進化樹上位于相對獨立而保守的一個分支；韋氏芽胞桿菌與蕈狀芽胞桿菌雖然在菌落形態上差異很大，但兩者在系統進化樹上位于同一個分支，同源性極高。