水楊酸鈉誘導大鼠螺旋神經節細胞發生程序性壞死的研究*

黃巧 尹時華 侯濤 任毅 廖行偉 翟思佳 王曉榮

程序性壞死是由受體相互作用蛋白激酶介導的非依賴半胱天冬酶(caspase)的一種新型細胞死亡方式，在形態上與壞死非常相似，與傳統的細胞壞死不同，其可以受調控，且在凋亡介導的胱天蛋白酶被抑制情況下被激活。當被病毒感染或caspase-8激活受抑制時，死亡配體[包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Fas配體和TNF相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)]依次進行磷酸化和激活受體相互作用蛋白激酶-1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)和受體相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)，活化的RIPK3使混合系列蛋白激酶樣結構域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)磷酸化，導致MLKL的構象變化，磷酸化的MLKL形成寡聚體，并易位至生物膜上，從而通過形成孔道和破壞膜完整性而導致壞死[1～3]。因此，由RIPK1、RIPK3和MLKL組成的蛋白復合物稱為壞死體，是程序性壞死的關鍵調控分子[4]。一些研究表明RIPK3可能參與螺旋神經節(SGN)的損傷，Wang等[5]利用哇巴因建立SGN損傷模型研究發現，RIPK3介導的程序性壞死參與SGN損傷。Choi等[6]在體外和體內研究發現，RIPK3介導的程序性壞死是順鉑誘導耳毒性的主要細胞死亡途徑。但水楊酸鈉耳毒性是否存在RIPK1/RIPK3/MLKL途徑參與的程序性壞死尚無研究報道。本課題組先前研究發現，水楊酸鈉通過激活caspase-3誘導豚鼠耳蝸SGN發生細胞凋亡，但經特異性caspase-3抑制劑處理后凋亡細胞減少不明顯，其可能有不依賴caspase-3的凋亡途徑存在[7]，由此提出，水楊酸鈉可能損傷SGN,可能存在RIPK1/RIPK3/MLKL途徑參與的程序性壞死。程序性壞死特異性抑制劑necrostatin-1(Nec-1)，對RIPK1作用具有高度特異性，在超過400種人類激酶的篩選中，Nec-1對RIPK1的選擇性較其他激酶高出1 000倍以上，其能夠抑制RIPK1活性，阻斷程序性壞死的進行，在損傷模型中起保護作用[8, 9]。因此，本研究采用Nec-1干預程序性壞死途徑，探討RIPK1/RIPK3/MLKL介導的程序性壞死在水楊酸鈉誘導大鼠SGN損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選擇耳廓反應靈敏、鼓膜完整且未暴露于噪聲環境及無耳毒性藥物使用史的健康雄性成年SD大鼠，體重280～330 g，實驗前進行ABR檢測，篩選ABR反應閾小于40 dB SPL的48只合格大鼠，隨機分為空白對照組、人工外淋巴液(artificial perilymph,APL)組、水楊酸鈉(sodium salicylate,SS)組和Nec-1組,每組12只。

1.2主要試劑 人工外淋巴液(APL配制：NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl22 mM, NaH2PO41 mM, Glucose 10 mM, NaHCO312 mM, MgCl21 mM的溶液，pH 7.4±0.2)，水楊酸鈉購于sigma公司，Nec-1(11658，Cayman Chemical，USA)，逆轉錄盒與熒光定量PCR試劑盒購于GeneCopoeia，RIPK1抗體(bs-5805R，bioss)，RIPK3抗體(BS7363，bioworld)，MLKL抗體(K004074P，solarbio)。引物利用Primer Premier設計，通過BLAST分析，挑選最佳序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，RIPK1引物序列為F:5′CCAGCCAGCCAAATCAAAGT3′；R: 5′TGGCTTACACTTGGCCCATA3′，產物長度198 bp。RIPK3引物序列為F:5′TAGTTTATGAAATGCTGGACCGC3′；R: 5′GCCAAGGTGTCAGATGATGTCC3′，產物長度145 bp。MLKL引物序列為F:5′TCTCCCAACATCCTGCGTAT3′；R: 5′TCCCGAGTGGTGTAACCTGTA3′，產物長度104 bp。選取GPHAD作為內參對照，序列為F: 5′AGTGCCAGCCTCGTCTCATA3′；R:5′TGAACT TGCCGTGGGTAGAG3′，產物長度189 bp。

1.3聽性腦干反應(ABR)檢測 所有動物實驗前與動物處死前(最后一次給藥12小時后)均進行ABR檢測。采用Neuro-Audio.聽覺誘發電位儀，操作軟件為Neuro-Audio.v2010，麻醉滿意后將大鼠置于隔聲室，記錄電極置于額頂正中，參考電極置于同側耳廓，接地電極置于鼻尖。click短聲刺激，刺激率21次/秒，帶通濾波300～3 000 Hz，疊加次數1 024次，強度從90 dB SPL開始并以10 dB或者5 dB遞減，以能引出明確重復的、可檢測到的波II的最小刺激強度為ABR反應閾，并重復檢測2次。

1.4各組用藥及給藥方法 空白對照組：左耳經圓窗注入人工外淋巴液，腹腔注射生理鹽水；APL組：左耳經圓窗注入含Nec-1人工外淋巴液；SS組：左耳經圓窗注入人工外淋巴液后腹腔注射水楊酸鈉350 mg·kg-1·d-1；Nec-1組：左耳經圓窗注入Nec-1后經腹腔注射水楊酸鈉350 mg·kg-1·d-1；圓窗給藥24小時后給予腹腔注射，各組連續給藥7天。圓窗給藥方法：10%水合氯醛全身麻醉滿意后將大鼠置于固定板上，左耳后常規備皮、消毒、鋪巾，利多卡因局部浸潤麻醉，于耳后溝后2 mm做弧形切口約1 cm長，鈍性分離軟組織，暴露聽泡，在解剖顯微鏡下于聽泡后上方用鉆孔并暴露圓窗龕，以分別浸泡有人工外淋巴液、Nec-1的明膠海綿置于圓窗膜表面，Nec-1濃度(300 μM)和劑量(100 μL)根據以前的報道選擇[10]。關閉術腔，逐層縫合軟組織及皮膚，切口涂紅霉素軟膏，取左耳朝上側臥位，待自然清醒。

1.5耳蝸取材及切片制備 待各組動物最后一次檢測ABR后，打開胸腔，剪開右心耳，以生理鹽水及4%多聚甲醛灌注心臟，待頭頸四肢僵硬快速斷頭，打開聽泡取出耳蝸，在解剖顯微鏡下打開圓窗及前庭窗，于蝸尖處挑開小孔，用1 ml注射器由蝸頂灌注4%多聚甲醛，再將標本置于4%多聚甲醛4 ℃固定48 h。取出耳蝸置于10%EDTA溶液室溫脫鈣1個月，隔天更換一次脫鈣液。隨后經脫水、透明、石蠟包埋后切片，片厚4 μm。

1.6HE染色 石蠟切片置于60 ℃烤箱3 h，將切片取出進行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；蒸餾水沖洗，蘇木素染色5 min，水洗；蒸餾水浸泡1 min；1%鹽酸酒精分化數秒，自來水返藍30 min，伊紅染色2 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干封片，鏡檢。為了進行定量分析，在10×40視野下總共對SGN區的壞死細胞數進行五次計數，計算出100個SGN細胞中已經壞死的細胞數量。

1.7RNA提取和實時熒光適量PCR(qRT-PCR)法 待大鼠麻醉充分快速斷頭，迅速取出耳蝸置入無酶水配制的PBS溶液中，在解剖顯微鏡下剝離蝸殼，取出膜迷路組織并迅速放入含有TRIZOL的1.5 ml EP管中，用玻璃研磨棒將組織完全研磨碎，冰上放置10 min。12 000 g 4 ℃離心5 min，吸取上清液加入200 μl氯仿震蕩15 s，冰上靜置5 min。12 000 g 4 ℃離心15 min，吸取上層水相層，加入200 μl異丙醇與200 μl高鹽溶液(0.8 mol/L檸檬酸鈉與1.2 mol/L NaCl的混合液)，顛倒混勻后冰上靜置10 min。12 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清保留沉淀并加入75%乙醇1 ml洗滌沉淀。12 000 g 4 ℃離心5 min，倒去乙醇，晾干沉淀，無酶水溶解RNA。測RNA濃度，并分裝保存于-80 ℃。取總RNA 1 μg，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，然后通過美國ABI公司的Stepone進行qRT-PCR。以1 μl cDNA為反應模板，按照熒光定量PCR試劑盒說明書配置反應20 μl體系進行qRT-PCR。反應條件：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃32 s，循環40次。選取GPHAD作為內參對照，采用2-△△Ct法進行數據分析，檢測各組大鼠SGN RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表達水平。

1.8免疫組織化學染色 石蠟切片置于60 ℃烤箱3 h，將切片取出進行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，蒸餾水沖洗；切片置于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)放入高壓鍋高壓修復5 min，室溫冷卻后PBS浸洗；阻斷內源性過氧化物酶10 min，PBS沖洗；滴加一抗(RIPK1∶PBS=1∶400,RIPK3∶PBS=1∶100,MLKL∶PBS=1∶200，陰性對照用0.01 MPBS代替一抗)，4 ℃濕敷過夜；室溫復溫1 h，PBS沖洗；滴加反應增強液10 min，PBS沖洗；滴加增強酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物10 min，PBS沖洗；DAB溶液顯微鏡下顯色；蘇木素復染，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水返藍30 min；脫水，透明，晾干，封片、鏡檢。細胞膜和/或細胞質棕黃色顆粒者為陽性表達，無棕黃色顆粒者為陰性表達。在10×40視野下選取螺旋神經節區域，采用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測定單位面積陽性細胞表達的平均光密度值(Average optical densities，AOD)，檢測各組大鼠SGN RIPK1、RIPK3、MLKI蛋白表達。

2 結果

2.1各組用藥前后ABR反應閾比較 給藥前各組大鼠雙耳ABR閾值均低于40 dB SPL。給藥后各組間ABR反應閾差異有統計學意義(F=101.962，P<0.000 1)，經兩兩比較，給藥后對照組和APL組ABR閾值差異無統計學意義(P=0.149)。給藥后水楊酸鈉組ABR閾值較對照組和APL組升高(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)。Nec-1組ABR閾值較水楊酸鈉組降低(P<0.000 1)，但較對照組和APL組仍有升高(P<0.000 1，P<0.000 1)，差異有統計學意義。Nec-1組經抑制劑處理后ABR反應閾較水楊酸鈉組降低(P<0.000 1)，但較對照組及APL組仍有升高(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)(表1)。

表1 各組大鼠左耳給藥前后ABR閾值比較

2.2各組HE染色SGN細胞形態及壞死細胞計數比較 對照組及APL組SGN細胞清晰(圖1a、b)，但仍存在少許壞死細胞。與對照組相比，水楊酸鈉組SGN的形態學變化明顯，具有細胞死亡特征，表現為細胞變圓，細胞質腫脹，細胞界限不清(圖1c)；Nec-1組壞死細胞數量較水楊酸鈉組減少(圖1d)。對照組、APL組、水楊酸鈉組及Nec-1組SGN中壞死細胞計數分別為11.6%±1.517%、12.8%±1.483%、47.8%±2.387%及30.6%±1.140%，各組間壞死細胞計數比較差異有統計學意義(F=361.228，P<0.000 1)；與對照組相比，水楊酸鈉組SGN壞死細胞計數最高，差異有統計學意義(P<0.000 1)；Nec-1組SGN壞死細胞計數較水楊酸鈉組少(P<0.000 1)，但較對照組仍有升高(P<0.000 1)；而對照組與APL組壞死細胞計數差異無統計學意義(P=0.28)。

2.3qRT-PCR顯示各組大鼠SGN中RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表達量 qRT-PCR結果顯示GPHAD、RIPK1、RIPK3和MLKL的擴增曲線整齊均勻(圖2)，溶解曲線均呈特異性單峰(圖3)，表明擴增產物特異性良好、無二聚體及非特異性擴增。各組間RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA的表達量有明顯差異(P<0.000 1，P<0.000 1，P<0.000 1)，其中，對照組中表達水平表達均最低，水楊酸鈉組表達強烈增加，Nec-1組表達量均明顯低于水楊酸鈉組(表2)。

表2 各組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表達量

2.4免疫組化結果 免疫組化結果顯示RIPK1、RIPK3和MLKL主要表達在SGN的細胞質、細胞膜及部分細胞核處；對照組和APL組SGN區域幾乎無表達，水楊酸鈉組SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL的表達明顯增加，Nec-1組RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的表達量較低，但Nec-1組仍較對照組表達升高，該蛋白質表達模式與mRNA表達模式一致，各組間RIPK1在SGN的表達量有明顯差異(F=274.607，P<0.001)。經兩兩比較發現，與對照組和APL組相比，水楊酸鈉組的SGN中RIPK1表達強烈增加(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1組SGN中RIPK1表達量較水楊酸鈉組明顯降低(P=0.001)，但Nec-1組與對照組、APL組比較，RIPK1表達水平仍有升高(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)(圖4)。各組間RIPK3在SGN的表達量有明顯差異(F=292.711，P<0.000 1)，與RIPK1表達結果一致，與對照組和APL組相比，水楊酸鈉組的SGN中RIPK3表達強烈增加(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1組SGN中RIPK3表達量顯著低于水楊酸鈉組(P<0.000 1)，但仍高于對照組和APL組(分別為P=0.002，P=0.004)(圖5)。各組間MLKL在SGN的表達量有明顯差異(F=89.591，P<0.000 1)，與RIPK3表達結果一致，與對照組和APL組相比，水楊酸鈉組的SGN中MLKL表達強烈增加(P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1組SGN中MLKL表達量較水楊酸鈉組降低(P<0.000 1)，但仍高于對照組、APL組(分別為P=0.006，P=0.008)(圖6)。

3 討論

程序性壞死可能是SGN細胞死亡的基本和替代/補充機制，在阻斷細胞凋亡途徑后進一步揭示，當凋亡介導的胱天蛋白酶被抑制時，由RIPK1和RIPK3執行程序性壞死。RIPK1和RIPK3參與炎癥和細胞死亡，MLKL被RIPK3磷酸化激活，形成壞死體而導致細胞程序性壞死[11, 12]。先前的研究不斷探索水楊酸鈉誘導耳鳴的分子機制，caspase3介導的凋亡通路已被證明是水楊酸鈉誘導SGN損傷中主要的死亡通路[13]。在體內水楊酸鈉通過影響環氧合酶活性，阻斷花生四烯酸向前列腺素H2轉化，花生四烯酸濃度的增加會影響N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，同時引起外周和中樞效應，NMDA受體在內部毛細胞和耳蝸螺旋神經節神經元的突觸上表達[14]。在體外，水楊酸鈉增強了NMDA類在耳蝸螺旋神經節神經元上的谷氨酸能電流[15]，將NMDA拮抗劑直接應用到耳蝸液中，可阻止水楊酸鈉誘導的耳鳴[16]，這些研究表明水楊酸鈉耳毒性機制非常復雜，涉及多條通路，然而程序性壞死是否也參與水楊酸鈉誘導的耳毒性尚無報道。

程序性壞死可被死亡配體[包括腫瘤壞死因子(TNF)，Fas配體和TRAIL]誘導，Hwang等[17]觀察到在小鼠耳蝸中注射300 mg/kg水楊酸鈉可使腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor type 1,TNFR1)mRNA表達水平高于腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor type 2,TNFR2)的mRNA表達水平。長期施用水楊酸鈉后，TNFα基因的表達增加，然而在停止水楊酸鈉給藥后14天，TNFα mRNA的表達水平又回到了正?；€[18]。此外，Wei等[19]研究發現水楊酸鈉處理3小時后，Tnfsf10(TRAIL)、Lta(TNFSSF1)、Fas和Tnfrsf5 4個TNF家族的成員顯示上調，這些研究表明水楊酸鈉誘導的耳鳴可能與TNFα基因的過表達有關。本研究結果顯示，水楊酸鈉誘導的耳毒性與SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL，即壞死體的高表達水平顯著相關，反映了壞死性細胞死亡途徑，使用Nec-1處理時，RIPK1、RIPK3和MLKL表達降低，這表明在水楊酸鈉致SGN損傷中存在RIPK1/RIPK3/MLKL介導的程序性壞死，阻滯該途徑對于有效的神經保護可能是必需的。但是，需要進一步研究分別敲除小鼠RIPK1、RIPK3和MLKL基因在水楊酸鈉誘導的耳毒性中的作用。

Nec-1是程序性壞死特異性抑制劑，能夠抑制RIPK1活性，阻斷程序性壞死的進行。Nec-1已廣泛用于實驗模型研究受體相互作用蛋白激酶在程序性壞死中的作用。Zheng等[10]在噪聲性聽力損失模型中研究發現，噪聲暴露一小時后，耳蝸基底部區域中的外毛細胞RIPK1和RIPK3蛋白水平增加，呈現凋亡和壞死特征，用Nec-1進行治療可減少噪聲引起的RIPK1和RIPK3增加，并減少外毛細胞壞死。Wang等[5]也報道哇巴因引起的SGN損傷促進RIPK3表達增加，但可通過應用Nec-1來抑制。本研究Nec-1組SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL表達降低，且SGN中細胞的壞死率減少，與上述研究結果一致；然而，Ruhl等[20]報道Nec-1的保護作用在順鉑誘導耳毒性的離體外毛細胞實驗中未得到反映。表明藥物誘導的耳毒性非常復雜，存在由胱天蛋白酶和RIP激酶相互調節，任一途徑的抑制可能導致死亡向另一途徑轉移，因此，Nec-1抑制程序性壞死可保護SGN細胞免受損傷。

SGN的損傷不僅可導致感音神經性聽力損失，也可能是水楊酸鈉引起耳鳴的機制之一，本研究提示程序性壞死是一種SGN損傷的重要途徑，其重要性與細胞凋亡相似；抑制程序性壞死以保護SGN免受損傷，可能是治療耳鳴和SGN損傷相關性聽力損失的一種方法。