基于微流控芯片的復方木雞顆粒誘導HepG2細胞凋亡作用研究

孫悅，包永睿，2，3，王帥，2，3，李天嬌，2，3，孟憲生，2，3*（.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業技術創新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600）

目前，微流控芯片技術在藥物研發領域中發展迅速，憑借其高通量、低消耗等優勢成為21 世紀分析科學及生命科學等眾多領域的研究熱點[1]。肝癌因其發病隱匿、致死率高，成為目前對人類健康和生命威脅極大的惡性腫瘤之一[2]。雖然手術治療、放療、化療等都有一定效果，但肝癌患者5年的生存率仍不足20%，且復發率極高，因此尋找有效的抗肝癌藥物迫在眉睫。作為傳統滿藥第一方——復方木雞顆粒是由云芝提取物、核桃楸皮、山豆根、菟絲子4味中藥組成。云芝性甘、平，入心、脾、肝、腎經，具有健脾利濕、清熱解毒的功效，常用于濕熱黃疸、脅痛、納差、倦怠乏力等[3]，現代研究[4]表明其具有較好的增強免疫、抗腫瘤等藥理作用，為該方君藥；輔以具有清熱解毒作用的山豆根、核桃楸皮，以及具有補肝益腎作用的菟絲子共同發揮抗肝炎、肝硬化、肝癌等藥理作用。根據文獻調研[5-6]及前期課題組[7]研究發現，復方木雞顆粒具有誘導肝癌細胞凋亡的作用，但其各組分藥效作用尚不明確，故本實驗將微流控芯片技術與中藥復方相結合，針對中藥復方藥效篩選復雜又繁瑣的問題，構建一種多功能的高通量藥物篩選芯片，并考察芯片的適用性；同時利用該芯片開展復方木雞顆粒及其各組分誘導肝癌HepG2 細胞凋亡作用研究。

1 材料

1.1 細胞株

人肝癌HepG2 細胞購于齊氏（上海）生物科技有限公司。

1.2 試藥

復方木雞顆粒（規格：10 g/袋，批號：18080224），核桃楸皮、菟絲子、山豆根、云芝藥材由丹東藥業提供，均經遼寧中醫藥大學藥用植物教研室許亮教授鑒定，分別為胡桃科植物核桃楸Juglans mandshuricaMaxim.的干燥樹皮、菟絲子亞科植物菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子、豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖、多孔菌科真菌彩絨革蓋菌Coriolus versicolor（L.ex Fr.）Quel 的干燥子實體。

紫杉醇注射液（山西普德藥業股份有限公司）；負性環氧樹脂光刻膠SU-8 及顯影液（美國Micro-Chem 公司）；Sylgard 184 型聚二甲基硅氧烷PDMS 及固化劑（美國Dow-Corning 公司）；達爾伯克改良伊格爾氏培養基DMEM、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（美國GIBCO 公司）；細胞凋亡/壞死檢測試劑盒[含Hoechst 33342 染液和碘化丙啶（PI），碧云天生物技術研究所]；細胞死活檢測試劑盒（鈣黃素Calcein-AM/PI，北京索萊寶科技有限公司）；青、鏈霉素混合溶液（美國Hyclone 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 儀器

LSP04-1A 型精密注射泵（保定蘭格公司）；NIKON ECLIPSE TI 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；TG-2U 型光刻機（北京中科同志科技有限公司）；HPDC-32G-2 型等離子清洗機（Harrick Plasma 公司）；SC-1B 型勻膠機、BP-2B 型烘膠臺（北京創世威納科技有限公司）；W2001R 型CO2培養箱（美國SIM 公司）。

2 方法

2.1 復方木雞顆粒各組分的制備

2.1.1 核桃楸皮黃酮 取適量核桃楸皮藥材粉末，以15 倍生藥量的60%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合并2 次濾液，水浴加熱濃縮至0.1 g·mL－1生藥濃度，以等體積的AB-8 濕樹脂進行純化，2 倍柱體積三級水除雜，再用12 倍柱體積60%乙醇洗脫，洗脫液重復上述純化方法進行二次純化，二次洗脫液水浴加熱濃縮至近干，減壓干燥，即得[8]。

2.1.2 菟絲子黃酮 取適量菟絲子藥材粉末，以15 倍生藥量的95%乙醇加熱回流提取3 次，每次1.5 h，合并3 次濾液，水浴加熱濃縮至0.1 g·mL－1生藥濃度，將濃縮液pH 調至5，以1.1倍體積的HPD-400 濕樹脂進行純化，2 倍柱體積三級水除雜，再用4 倍柱體積60%乙醇洗脫，洗脫液水浴加熱濃縮至近干，減壓干燥，即得[9-10]。

2.1.3 山豆根生物堿 取適量山豆根藥材粉末，以10 倍生藥量的65%乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h，合并2 次濾液，水浴加熱濃縮至0.8 g·mL－1生藥濃度，將濃縮液pH 調至5，以0.8 倍體積的HPD-300濕樹脂進行純化，2倍柱體積三級水除雜，再用8 倍柱體積65%乙醇進行洗脫，二次洗脫液水浴加熱濃縮至近干，減壓干燥，即得[11]。

2.1.4 菟絲子多糖 取適量菟絲子藥材粉末，以20 倍生藥量的三級水加熱回流提取2 次，每次1 h，合并2 次濾液，水浴加熱濃縮至0.5 g·mL－1生藥濃度，加入過量80%乙醇混勻，靜置醇沉24 h，濾過后水溶除雜，加熱稍濃縮后涂于高溫清潔滅菌處理過的搪瓷托盤內壁，置入真空干燥裝置內常溫干燥。

2.1.5 山豆根多糖 取適量山豆根藥材粉末，以10 倍生藥量三級水加熱回流提取3 次，每次1 h，合并3 次濾液，水浴加熱濃縮至1.0 g·mL－1生藥濃度，加入過量75%乙醇混勻，靜置醇沉12 h，同“2.1.4”項下方法進行除雜和干燥[12]。

2.1.6 云芝多糖 取適量云芝藥材粉末，以30倍生藥量三級水加熱回流提取3 次，每次2 h，合并3 次濾液，水浴加熱濃縮至1.0 g·mL－1生藥濃度，加入過量70%乙醇混勻，靜置醇沉24 h，同“2.1.4”項下方法進行除雜和干燥。

上述提取純化方法是在本課題組前期大量文獻調研以及實驗得出的制備方法的基礎上進一步優化而得，按照上述方法制備6 個組分，獲得相應組分的干膏，密封后置于干燥器中保存。

2.2 溶液的配制

2.2.1 紫杉醇的配制 吸取適量紫杉醇注射液，用DMEM 培養基配制成30 μL·mL－1的溶液，4℃備用。

2.2.2 細胞含藥培養液的配制 稱取適量復方木雞顆粒及上述6 個組分純化物，分別配制成質量濃度為6 mg·mL－1和1 mg·mL－1的細胞含藥培養液，過0.22 μm 微孔濾膜，所得藥液作為儲備液。

2.3 芯片的設計與制作

本實驗構建一種多功能的高通量藥物篩選芯片，分為上下兩部分，依次為PDMS 流體通道層和玻璃基片層，如圖1所示。主要通道為流體通道，包括流體通道區和細胞培養區，長5.5 cm，寬2.5 cm，其厚度約3 mm，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l 為12個細胞及藥物入口，o 為廢液出口；本實驗將a、b、c、d、e、f、g、h 作為給藥的8 個入口，i、j、k、l 用作細胞培養及活力檢測實驗的入口，o 為共用廢液口；細胞培養區由6×6 列培養通道組成，每條通道設有4 個復孔，培養腔為橢圓形，尺寸為1.0 mm×1.2 mm。

圖1 微流控芯片示意圖Fig 1 Schematic diagram of microfluidic chip

芯片采用實驗室微流控技術，通過軟光刻、模塑法以及氧等離子體鍵合三大技術手段制得[13-14]。該芯片可實現細胞培養、藥物及組分配伍、藥物對細胞刺激、結果生成與檢測等多種功能。實物圖如圖2所示。

圖2 微流控芯片實物圖Fig 2 Physical diagram of microfluidic chip

2.4 芯片預處理

將芯片的流體通道層先用75%乙醇清洗3遍，再通入純水清洗3 遍，烘干，置于超凈工作臺紫外照射30 min 后即可使用。

2.5 芯片中細胞培養及活力檢測

取HepG2 細胞，使用DMEM 培養液（10%胎牛血清、1%的青鏈霉素混合溶液）于細胞培養箱中（37℃、5% CO2、飽和濕度）常規培養，待細胞處于對數生長期時，將細胞密度調整為5×105個·cm－2，接種于芯片中，待細胞貼壁后，將培養液以0.2 μL·min－1的流速經微量注射泵注入芯片中進行動態培養。同時，將HepG2 細胞在微流控芯片中分別培養24、48、72 h 后，用細胞檢測死活試劑盒對細胞進行染色，檢測HepG2細胞的活力，計算芯片中細胞的存活率，細胞存活率（%）＝活細胞數/（活細胞數＋死細胞數）×100%。

2.6 芯片中復方木雞顆粒及其各組分對HepG2細胞的促凋亡壞死作用

待芯片中細胞密度在80%左右時，用精密注射泵以0.2 μL·min－1的速度進行給藥刺激，當不同組分藥液分別作用HepG2 細胞24、48 和72 h 后，停止給藥，用微量注射器吸取一定量的PBS，緩慢注入細胞培養通道內對細胞進行清洗后，從培養液入口處以0.2 μL·min－1的流速通入Hoechst 33342 和PI 染液進行雙染，使用熒光倒置顯微鏡拍照，并運用IPP（Image-Pro Plus 6.0）圖像分析軟件對圖像進行處理分析，計算細胞凋亡壞死率，檢測不同組分的藥效差異，細胞凋亡壞死率（%）＝（凋亡細胞數＋壞死細胞數）/細胞總數×100%。

2.7 數據分析

采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析，所有數據均用（±s）表示，組間比較采用單因素方差。P＜0.05 代表差異有統計學意義。

3 結果

3.1 芯片中HepG2 細胞生長狀態及細胞活力

按照“2.5”項下方法培養細胞，結果發現，HepG2 細胞在芯片細胞培養腔中培養4 h 后基本貼壁，24、48、72 h 后通過熒光倒置顯微鏡觀察發現，細胞完全伸展，胞質透明，形態正常，如圖3所示。細胞在芯片中的生長狀態良好，細胞存活率均在96%以上，如圖4所示。

圖3 顯微鏡下不同時間點空白組細胞生長狀態（10×）Fig 3 Cell growth states of blank group at different time points（10×）

圖4 不同時間點空白組細胞死活檢測試劑盒雙染熒光圖片Fig 4 Live/Dead double-stained fluorescence images of cells in blank group at different time points

3.2 復方木雞顆粒及其各組分對HepG2 細胞的促凋亡壞死作用

復方木雞顆粒及其各組分同時對細胞進行24、48 和72 h 的刺激，用Hoechst 33342/PI 對細胞進行雙染。結果見表1及圖5。

表1 復方木雞顆粒及其各組分對HepG2 細胞凋亡壞死率的影響(±s，n ＝4，%)Tab 1 Effect of Fufang Muji granules and their active components on apoptosis and necrosis rate of HepG2 cells (±s，n ＝4，%)

表1 復方木雞顆粒及其各組分對HepG2 細胞凋亡壞死率的影響(±s，n ＝4，%)Tab 1 Effect of Fufang Muji granules and their active components on apoptosis and necrosis rate of HepG2 cells (±s，n ＝4，%)

注：與空白組比較，*P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05.

組別 時間24 h 48 h 72 h空白組 1.15±0.26 1.13±0.23 1.36±0.34紫杉醇 43.36±0.55* 58.07±0.35* 74.25±0.23*復方木雞顆粒 33.04±0.78* 56.58±0.65* 70.25±0.88*核桃楸皮黃酮 52.84±1.17* 74.13±0.57* 89.82±0.87*菟絲子黃酮 38.45±0.47* 55.03±1.60* 68.21±1.07*山豆根生物堿 29.02±1.23* 42.54±0.57* 58.24±0.37*菟絲子多糖 1.52±0.25 2.26±0.19 3.24±0.36山豆根多糖 1.26±0.42 2.93±0.22 3.53±0.35云芝多糖 1.99±0.39 2.50±0.53 2.86±0.19

圖5 6 個組分作用于HepG2 細胞48 h 后的Hoechst 33342/PI 雙染熒光圖Fig 5 Hoechst 33342/PI Kit double-stained fluorescence of HepG2 cells treated with 6 active components for 48 h

結果表明，刺激48 h 時，復方木雞顆粒組分中，對細胞的凋亡壞死率較高的為核桃楸皮黃酮、菟絲子黃酮和山豆根生物堿，其中核桃楸皮黃酮的藥效優于菟絲子黃酮；山豆根生物堿的藥效次之于兩種黃酮類成分，這3 種組分對細胞的凋亡壞死率與空白組相比差異均有統計學意義。而方中的另外3 組多糖類成分的藥效則相對較差，其對細胞凋亡壞死率均小于3%。

4 討論

隨著顯微熒光影像、圖像分析處理等技術的不斷進步與發展，微流控芯片技術在抗腫瘤類藥物篩選領域將擁有巨大的發展前景[15]。微流控芯片技術的優勢在于可克服傳統96 孔板技術操作繁瑣、重復性差以及人為誤差較大等實際問題，實現了在微尺度反應室內的動態培養，更加貼近細胞的微生理環境。此外，用蠕動泵以流速0.2 μL·min－1進行動態灌注，作用48 h 后的藥液消耗量還不足0.6 mL，大大減少了藥液的消耗[16]。芯片流體通道共用一個廢液口，這樣大大降低了操作難度，且每列細胞培養腔都設計了彎曲的流阻結構，這樣的設計可保證液體不倒流，實現不同濃度或不同組分藥液的同時給藥刺激，既能減小實驗誤差，也能節約實驗時間[17]。本實驗設計的芯片可實現12 種藥物的同時在線篩選，即藥物的高通量篩選，若想篩選更多組分藥效，也可通過增加更多的細胞培養區結構單元來實現，該類芯片尤其適用于中藥復方的藥效篩選。簡而言之，微流控芯片用于高通量的藥物篩選具有一定的應用優勢及開發價值。

本實驗基于一種多功能的高通量藥物篩選芯片，采用Hoechst 33342/PI 雙染法探討復方木雞顆粒及其各組分給藥24、48 和72 h 后對HepG2細胞的凋亡影響。而選用該染色方法的依據是該法在熒光顯微鏡下觀察效果較Annelid V-FITC/PI好，且易操作、結果穩定可靠、重復性較好。由研究結果得知，除多糖類之外的3 個組分均具有較好的誘導HepG2 細胞凋亡的藥理活性，核桃楸皮黃酮和菟絲子黃酮的藥效與紫杉醇無顯著性差異，說明其促腫瘤細胞凋亡的能力較強，山豆根生物堿也具有較好的凋亡壞死率。通過本實驗驗證以及文獻調研[18-20]，多糖類組分并不是通過直接性殺傷或誘導腫瘤細胞發生自我凋亡來發揮抗腫瘤作用，其本身不具有抗腫瘤活性，是通過增強免疫細胞增殖活性以及調節或促進細胞因子的分泌，作為協同或增效作用成分存在于配方中。

綜上所述，本實驗基于微流控芯片技術，將復方木雞顆粒整體拆分成不同組分，探討各組分的抗肝腫瘤藥效作用，揭示了復方木雞顆?？梢酝ㄟ^誘導腫瘤細胞凋亡來達到治療腫瘤的作用。本研究不僅為多組分中藥復方藥效篩選提供一種方便快捷的實驗方法，也為抗腫瘤中藥新藥研發提供了一定的參考價值。