用于口服固體制劑藥效學研究的大鼠DMH/DSS炎癥相關結直腸癌模型的建立

余玲，劉葭，郝逗逗，郭子右，劉玉娟，吳清（北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是當前全球最常見的癌癥之一，其中潰瘍性結腸炎是結直腸癌發展的重要風險因素，約20%的癌癥是由于長期反復慢性炎癥刺激引起的[1]。研究如何抑制結直腸炎的發生，阻斷“炎-癌轉化”，對結直腸癌的預防有重要作用。因此，建立穩定、可靠的炎癥相關結直腸癌動物模型具有非常重要的研究意義。目前該類模型可大致分為三類：化學誘導類，基因工程類和自發類[2]，其中化學誘導類應用最廣泛。目前較為常見的用來建立炎癥相關結直腸癌模型的造模誘導劑為 1，2- 二甲肼（1，2-dimethylhydrazine，DMH）、氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）聯合葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）。DMH/AOM 是構建炎癥相關結直腸癌模型常用的化學致癌劑，可以誘導大鼠/小鼠產生組織學表現類似于人散發性結直腸癌的結直腸腫瘤[3]，DSS 作為致炎劑的造模方法已經比較成熟與穩定，重復性好，在化學致癌劑與化學致炎劑的聯合作用下，能夠模擬炎癥性腸病逐漸發展為結直腸癌的“炎-癌轉化”過程[4]。

在結腸炎或炎癥相關結直腸癌藥物防治研究中，目前研究報道最多的是以微丸為代表的口服固體制劑，如美沙拉嗪腸溶緩釋微丸等[5-8]。微丸是一種粒徑小于2.5 mm 的球狀或類球狀口服固體劑型，具有比表面積大、生物利用度高、便于分劑量及適于組合、通過包衣方式實現不同釋藥性能、釋藥行為的重現性與一致性良好的特點[9]。然而在動物實驗藥效學研究方面，以微丸為代表的口服固體制劑存在給藥困難的問題，如制劑不能以常規方法粉碎、混懸后給藥，且實驗動物需要長期灌胃固體制劑，研究中常用的小鼠模型在此并不合適。通過查閱文獻發現，目前尚沒有明確、統一的炎癥相關結直腸癌大鼠模型的造模方案，不同造模方案中致癌劑的劑量、致炎劑的濃度、大鼠品系等并不一致，如DMH 多在10～40 mg·kg－1，DSS 多在0.5%～3%，實驗大鼠品系包括SD 大鼠、Wistar 大鼠、F344 大鼠等[10-15]。

當歸湯為中醫治療慢性結腸炎的經典方，首載于《外臺秘要·卷第二十五·數十年痢方一十一首》，文中記載“當歸湯，療三十年下痢，止諸痛方，當歸，生姜，大棗。上三味，以水四升，煮取一升半，分作三服，不瘥復作之”。前期研究并驗證了當歸超臨界提取物、酚酸類、多糖類的癌癥預防作用，并通過擠出-滾圓法制備當歸有效組分微丸制劑[16-19]，當歸、生姜超臨界提取物對2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）誘導的結腸炎模型具有治療作用[20]。同時，Zhang 等[21]采用超速離心法制備生姜納米粒，能夠靶向于炎癥損傷黏膜、阻斷損傷因子促進愈合因子，對DSS誘導的潰瘍性結腸炎和AOM/DSS 誘導的炎癥相關結直腸癌均有治療作用。大棗多糖可以改善TNBS 誘導的結腸炎程度，降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β和IL-6 表達，抑制炎性反應，增強腸屏障作用[22]。因此，當歸湯提取物（揮發油類、姜辣素類、多糖類等）及其微丸制劑具有預防炎癥相關結直腸癌的潛力。

因此，本研究設計DMH/DSS 復合法誘導Wistar 大鼠建立炎癥相關結直腸癌模型的不同造模方案，通過對宏觀指標的觀察和組織病理學檢查，判斷不同造模方案的造模效果，確定最佳造模方案。并以實驗室自制的當歸湯提取物及其微丸制劑給藥進行藥效學評價，通過宏觀指標、組織病理學檢查、炎癥因子指標等，驗證造模方法的可行性，以期為口服固體制劑應用于炎癥相關結直腸癌預防研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Bio Tek Epoch 全波長酶標儀（美國Bio Tek公司）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；PB-10 型pH 計、BSA224S型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；TS2-S-SM 光學顯微鏡（日本尼康公司）；ST 8R高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）等。

1.2 試藥

DMH（梯希愛上?；晒I發展有限公司）；DSS（分子量36 000～50 000，美國MP 公司）；當歸湯提取物、當歸湯提取物微丸（實驗室自制，當歸湯提取物中：藁本內酯含量為142.04 mg·g－1，6-姜辣素含量為81.89 mg·g－1，多糖含量為634.79 mg·g－1；當歸湯提取物微丸中：藁本內酯含量為18.63 mg·g－1，6-姜辣素含量為12.62 mg·g－1，多糖含量為246.95 mg·g－1）。福爾馬林固定液（北京博奧拓達科技有限公司）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司）；CMC-Na（天津市福晨化學試劑廠）；TNF-α、IL-1β的ELISA 試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）。

1.3 動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠（5～6 周齡），購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。

2 方法

2.1 大鼠DMH/DSS 炎癥相關結直腸癌模型的建立

2.1.1 動物造模方法 將40 只雄性Wistar 大鼠在恒溫恒濕環境下適應性喂養3 d，隨機分為4組，每組10 只。分組及處理方法如下：

① 空白組：不進行DMH/DSS 造模處理，正常攝食飲水。② 模型組1：自第1 周第1日起，每7日腹腔注射40 mg·kg－1DMH（以生理鹽水配制，NaHCO3調節pH 至6.5～7.0）一次，第1 周開始2% DSS 自由飲用7 d，蒸餾水自由飲水7 d，上述過程為一個循環（2 周），共重復4 個循環，共8 周。③ 模型組2：第1 周、第5 周、第9 周每周連續腹腔注射40 mg·kg－1DMH 3 次（第1、4、7日）。第2 周開始2% DSS 自由飲用7 d，然后蒸餾水自由飲水7 d，上述過程為一個循環（共2 周），共重復4 個循環，共8 周。④ 模型組3：在模型組1 的基礎上將2% DSS 全部換成3%DSS，其他造模步驟相同。實驗過程中觀察各組大鼠毛發、體質量、大便、耗水、及死亡情況。各組別飼養到第12、13 及14 周時，每周分別處死2 只大鼠進行取材，通過觀察結直腸組織病理結果判斷取材時間，并于第14 周將所有剩余大鼠進行取材處理。大鼠DMH/DSS 炎癥相關結直腸癌模型建立方法如圖1所示。

圖1 大鼠DMH/DSS 炎癥相關結直腸癌模型建立方法Fig 1 Establishment of DMH/DSS inflammation-related colorectal cancer rat models

2.1.2 動物取材與指標觀察 動物飼養過程中，每周稱量大鼠體質量并記錄。觀察大鼠健康狀況，肛門外觀形狀、大便、皮毛情況。實驗前大鼠禁食24 h，自由飲水，水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，剖開大鼠腹腔，取回盲竇處至肛門處的整段結直腸，拍照，徑向剖開腸壁，用生理鹽水清洗腸內壁糞便。測量長度后，統計腫瘤個數，于腫瘤病灶處剪取10～20 mm 結直腸組織標本，其中包括腫瘤組織及周邊正常組織，置 10%中性福爾馬林固定液中固定，置于干燥處保存，用于HE 染色實驗。

2.1.3 HE 染色與組織病理學診斷 固定于10%中性福爾馬林固定液的結直腸組織，經石蠟包埋，切片，HE 染色后，在顯微鏡下觀察組織病理變化，使用光學顯微鏡觀察大鼠結腸組織各項特征，包括黏膜完整性，杯狀細胞排列情況，炎性浸潤情況，隱窩結構改變，上皮內瘤變的程度及腫瘤的形成情況。根據WHO 消化系統腫瘤分類進行病理診斷，包括低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變和腺癌。

2.2 當歸湯提取物及其微丸制劑藥效學評價

2.2.1 模型建立與實驗分組 大鼠適應性飼養后，隨機分為4 組，每組6 只：對照組（control）、模型組（model）、當歸湯提取物組（簡稱提取物組，extract）、當歸湯提取物微丸組（簡稱微丸組，pellet）。除對照組外，參照“2.1”項下確定的造模方法，飼養到第14 周取材。對照組在相同時間腹腔注射生理鹽水，實驗期間自由飲用去離子水。

實驗第1日，即第1 次腹腔注射DMH 當日開始灌胃給藥，連續給藥14 周。微丸組采用自制微丸灌胃裝置給藥，提取物組使用灌胃針給藥。微丸灌胃方法如下：微丸倒入干燥的聚氯乙烯軟管中，軟管一段連接剪去針尖的注射器，另一端插入0.75% CMC-Na 溶液中，使用注射器吸取0.75% CMC-Na 溶液進入軟管，反復推拉注射器活塞排氣泡，使微丸均勻分散于0.75% CMCNa 溶液，將軟管插入大鼠食道，推動注射器活塞完成灌胃。實驗期間，每周監測大鼠體質量，日常觀察大鼠精神狀態、活動情況與毛發。

2.2.2 動物取材與指標觀察 實驗第14 周結束時取材，取材前大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛（3 mL·kg－1）腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，靜置，以3000 r·min－1離心10 min，收集上層血清，－80℃凍存待測；取出肛門至盲腸末端的整個腸段，測量長度；沿縱軸剖開結直腸，冰生理鹽水沖洗干凈后，用濾紙吸干，對腫瘤個數進行統計，測量腫瘤的長和寬，計算腫瘤體積[23][腫瘤體積＝（長×寬2）/2]，稱量整段結直腸質量；組織固定于10%中性福爾馬林固定液中用于HE染色。計算結直腸重量/長度、腫瘤個數、腫瘤體積和腫瘤發生率。

2.2.3 HE 染色及組織病理學診斷 方法同“2.1.3”項下HE 染色及組織病理學診斷。

2.2.4 血清中促炎細胞因子的測定 按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中促炎細胞因子TNF-α和IL-1β水平。

2.2.5 血清中鐵調素的測定 按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中鐵調素水平。

2.3 統計分析

實驗數據表示為mean±SD，使用Graphpad 6.0進行繪圖，采用one-way ANOVA 和Dunnetts 多重比較進行統計分析。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠DMH/DSS 炎癥相關結直腸癌模型的建立

3.1.1 大鼠體質量及一般生活狀況 實驗過程中，空白組大鼠飲食、飲水正常，毛色光亮，糞便正常，未出現便血、黏液便、萎靡不振、厭食等癥狀。其他3 組模型組大鼠均出現明顯的肛門紅腫、肉眼可見便血、毛發干枯、活力下降的情況，無大鼠死亡。其中DSS 給藥時便血嚴重，停止給藥后癥狀緩解。各組大鼠體質量變化曲線如圖2?？瞻捉M大鼠體質量整體高于各模型組，各模型組之間無明顯差異。

圖2 各組大鼠體質量變化曲線圖Fig 2 Rat mass change curves of each group

3.1.2 宏觀指標分析 每組大鼠分別在第12 周取材2 只，空白組大鼠結直腸黏膜組織完整，模型組1 大鼠結腸表面有肉眼可見輕微凸起，無明顯菜花狀增生組織，黏膜輕微破壞，模型組2 肉眼可見凸起較為嚴重，黏膜部分破壞，模型組3 肉眼可見凸起、黏膜破壞均較為嚴重；在第13 周分別取材2 只，發現病理變化不明顯，與第12 周相近；飼養至第14 周分別取材2 只發現模型組1、2、3 結腸凸起均明顯，且以模型組3 最為嚴重，因此于14 周全部取材。14 周各組大鼠結直腸長度、腫瘤個數見圖3，與空白組相比，各模型組結直腸長度及腫瘤個數差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠結直腸長度（A）與腫瘤個數（B）（n ＝6）Fig 3 Rat colorectal length（A）and tumor number（B） of each group（n ＝6）

3.1.3 組織病理學分析 HE 染色結果顯示，第12 周時，空白組黏膜完整，隱窩結構正常，杯狀細胞排列整齊，間質內可見少量淋巴細胞浸潤；模型組1 大部分黏膜完整，隱窩結構正常，排列整齊，間質內可見少量淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，血管充血。黏膜下層可見明顯的淋巴濾泡。局灶表面上皮腺體結構不規則，排列紊亂，考慮為炎癥反應性改變；模型組2 部分顯示低級別上皮內瘤變，部分顯示高級別上皮內瘤變，部分顯示腺癌，侵至黏膜下層，靠近腸壁固有肌層；模型組3 部分顯示高級別上皮內瘤變，部分顯示腺癌，侵至黏膜下層。第14 周時，空白組黏膜結構完整，隱窩結構尚可，黏膜間質內可見局灶淋巴細胞浸潤及淋巴濾泡形成；模型組1 可見低至中分化腺癌侵襲至漿膜層；模型組2、3 均已發展為腺癌，侵至固有肌層。各類型腫瘤的HE 染色如圖4所示。模型組1 與模型組2 比較可知，每周注射一次與一周連續注射三次的方法其模型結果相似，但是實驗過程中發現每周注射一次DMH，其大鼠活動狀態等相關可視化指標更加穩定，因此，選擇每周腹腔注射DMH 一次。大鼠飲用DSS 的濃度、周期與造模結果關系密切，模型組1 中使用2% DSS，于12 周時取材時大鼠的結直腸均處于炎癥狀態，而14 周時是早期腺癌，推測在12 周至14 周飼養過程中體現“炎-癌轉化”的變化過程，模型組3 使用3% DSS，于12周時已經表現出腺癌，說明其在12 周之前已經發生癌前病變，從經濟角度和實驗周期綜合考慮，確定模型組1 的造模方案為最佳造模方案。

3.2 當歸湯提取物及其微丸藥效學評價

3.2.1 大鼠體質量及一般生活狀況 實驗過程中，對照組大鼠飲食飲水正常，精神狀態良好，活潑好動，毛發有光澤，糞便正常。在飲用2% DSS的第1、3、5、7 周，模型組與各給藥組炎癥反應明顯，均可見不同程度的腹瀉和肉眼血便，改為飲用去離子水后，腹瀉與肉眼血便情況均得到緩解。如圖5所示，各組大鼠體質量在實驗周期內均呈上升趨勢。模型組大鼠體質量增長最緩，各給藥組大鼠體質量在實驗結束時均高于模型組。

3.2.2 結直腸重量/長度 疾病狀態下結直腸縮短和/或腫瘤生成均會引起結直腸重量/長度比值增大，一定程度上可以反映疾病的嚴重程度。各組大鼠結直腸重量/長度見圖6。由圖6可知，與對照組相比，模型組大鼠的結直腸重量/長度顯著增加（P＜0.01）；各給藥組大鼠的結直腸重量/長度與模型組相比顯著降低（P＜0.01），而與對照組之間差異無統計學意義，其中微丸組的結直腸重量/長度與對照組最接近。

3.2.3 腫瘤發生情況和組織病理學分析 各組大鼠結直腸宏觀狀態見圖7，腫瘤個數和體積見圖8，腫瘤發生率見表1。對照組大鼠結直腸黏膜完整光滑，沒有腫瘤發生；模型組大鼠結直腸均肉眼可見腫瘤狀突起，平均腫瘤數為（9.83±4.22）個，平均腫瘤體積為（199.49±97.28）mm3，腫瘤發生率為100%（6/6）。與模型組相比，提取物組和微丸組大鼠的腫瘤個數顯著減少（P＜0.01），腫瘤體積顯著減?。≒＜0.01，P＜0.0001），腫瘤發生率（均為66.7%）降低，且微丸組效果優于提取物組。

表1 各組大鼠腫瘤發生率(n ＝6，%)Tab 1 Tumor incidence rate of rats of each group (n ＝6，%)

結直腸組織HE 染色結果顯示，對照組大鼠結直腸組織黏膜完整，隱窩結構正常，排列整齊，杯狀細胞充足，有少量炎性細胞浸潤，沒有腫瘤發生。模型組與各給藥組的腫瘤惡性程度有所差異，模型組均為腺癌，可見低至中分化腺癌侵襲至漿膜層；提取物組和微丸組腫瘤均截止至上皮內瘤變階段，微丸組僅可見低級別上皮內瘤變，其腫瘤惡性程度改善效果最好。

3.2.4 大鼠血清炎癥因子水平 各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平見圖9。與對照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組大鼠血清中兩種炎癥因子水平顯著降低（P＜0.01）。微丸組的兩種炎癥因子水平低于提取物組，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 各類型結直腸病理變化HE 染色切片圖像（×100）Fig 4 Image of HE staining slices of pathological changes in colorectal tissue（×100）

圖5 各組大鼠體質量變化曲線（n ＝6）Fig 5 Rat mass change curves of each group（n ＝6）

圖6 各組大鼠結直腸重量/長度（n ＝6）Fig 6 Colorectal weight/length of rats of each group（n ＝6）

圖7 各組大鼠結直腸宏觀形態Fig 7 Colorectal macromorphology of rats of each group

3.2.5 大鼠血清鐵調素水平 各組大鼠血清鐵調素表達情況見圖10。與對照組相比，模型組大鼠血清鐵調素含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，提取物組與微丸組的鐵調素水平均顯著降低（P＜0.01）。同時微丸組的鐵調素水平低于提取物組，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖8 各組大鼠腫瘤個數（A）與腫瘤體積（B）（n ＝6）Fig 8 Tumor number（A）and tumor volume（B）of rats of each group（n ＝6）

圖9 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α（A）、IL-1β（B）（n ＝6）Fig 9 Inflammatory cytokines TNF-α（A）and IL-1β（B）in the serum of rats of each group（n ＝6）

圖10 各組大鼠血清鐵調素（n ＝6）Fig 10 Serum hepcidin of rats of each group（n ＝6）

4 討論

近年來炎癥相關的散發性結腸癌動物模型得到了很快的發展，以化學誘導類模型的應用最為普遍，DMH/AOM 聯合DSS 是常用的化學誘導劑，此類模型具有簡單易行，重現性好，具有與人類潰瘍性結腸炎癌變相似的特點，是其發病機制研究及防治藥物療效評估的比較理想的實驗動物模型[24-25]，目前主要使用小鼠作為研究對象，然而小鼠模型應用于以微丸為代表的口服固體制劑的藥效研究具有局限性，大鼠模型文獻雖然有報道，但是造模方法差異大，因此探索大鼠炎癥相關結直腸癌模型造模方法同樣具有重要的研究意義。

在前期實驗中參考課題組建立的小鼠模型造模方法[17，26]及文獻報道的大鼠造模方法[15]，使用SD 大鼠進行造模均未能成功復制模型，可能與SD 大鼠適應性及抗病能力較強有關[27]。通過相關文獻研究，擬確定使用DMH/DSS 化學誘導法建立炎癥相關結直腸癌Wistar 大鼠模型，并擬定不同的造模方案。通過預實驗可以大致確定取材時間為12 周至15 周，因此從第12 周開始每周隨機選取2 只大鼠進行取材判斷造模效果，至明顯病變周期時結束飼養。從空白組和各模型組大鼠實驗結果可以看出，DMH/DSS 聯合誘導能夠建立炎癥相關結直腸癌模型，40 mg·kg－1劑量的DMH 能夠有效發揮致癌作用，且隨著注射次數增加，致癌作用明顯。同時在前期預實驗中發現Wistar 大鼠、F344 大鼠均能建立較為穩定的炎癥相關結直腸癌模型，而Wistar 大鼠更為經濟，且同一周齡其體型比F344 大鼠大，更適合用于以微丸為代表的口服固體制劑研究，因此考慮以Wistar 大鼠作為造模對象。

基于所確定的DMH/DSS 誘導的大鼠炎癥相關結直腸癌模型造模方法，通過實驗室自制的當歸湯提取物及其微丸制劑的藥效學研究驗證造模方法的可行性。結果顯示，模型組平均腫瘤數、平均腫瘤體積、腫瘤發生率均高于其他組，腫瘤已發展至腺癌階段，其中平均腫瘤數為（9.83±4.22）個。藥物干預能夠減少結直腸腫瘤個數和體積，降低腫瘤發生率，延緩癌癥發展程度，其中微丸組對DMH/DSS 誘導的大鼠炎癥相關結直腸癌發生發展的預防作用比提取物組效果更明顯，腫瘤截止至低級別上皮內瘤變階段。本文以TNF-α、IL-1β為指標，從抑制炎癥反應角度探討預防結直腸癌的作用機制。促炎細胞因子TNF-α與IL-1β是促進炎癥相關結直腸癌發生發展的重要介質，即使結直腸癌已經發生，阻斷TNF-α也可以抑制其進展，提示靶向于TNF-α的藥物可能對潰瘍性結腸炎引起的結直腸癌具有治療作用[28]。中性粒細胞浸潤是慢性結腸炎及相關結直腸癌的重要特征，浸潤的中性粒細胞能夠分泌大量的IL-1β，阻斷IL-1β活性可以顯著減少黏膜損傷及腫瘤形成[29]。本研究結果表明，DMH/DSS 誘導的炎癥相關結直腸癌模型大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平顯著升高，經藥物干預后，兩者水平明顯降低，其中微丸組的作用最明顯。此外，鐵代謝異常與腫瘤的發生發展密切相關。鐵調素是鐵代謝的關鍵調節因子，在多種類型癌癥患者體內存在高表達，如乳腺癌、腎癌、肺癌、前列腺癌、胃癌和結直腸癌[30]，因此本文以鐵調素為指標，嘗試從調節鐵代謝角度探討預防結直腸癌的作用機制。結果表明，DMH/DSS 誘導的炎癥相關結直腸癌模型大鼠血清中鐵調素水平顯著升高，微丸組在改善鐵調素表達方面的作用優于提取物組。

綜上所述，本研究建立的炎癥相關結直腸癌大鼠模型，其造模方法簡單易行，重現性好，能夠用于口服固體制劑的藥效學研究，可以為炎癥相關結直腸癌防治藥物（尤其是口服固體制劑）的篩選與評價提供一定的實驗數據支持與參考。