焦磷酸測序檢測NUDT15基因多態性的方法學評價

張婕妤，初亞男，封利穎，鄒秉杰（東部戰區總醫院臨床藥學科，南京 210002）

巰嘌呤類藥物廣泛應用于自身免疫性疾病，在炎癥性腸病和兒童急性淋巴細胞白血病等的治療中發揮重要作用[1-2]，但會引起致命的白細胞減少癥進而導致治療中斷[3]。巰嘌呤甲基轉移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）是巰嘌呤類藥物代謝過程中的一種酶，其基因多態性與白細胞減少息息相關[4]。2005年美國FDA 推薦服藥前行TPMT分型檢測以降低不良發應的發生[5]，但亞洲人TPMT突變頻率雖遠低于歐洲人，白細胞減少的發生率卻比歐洲人高，因此可能存在其他因素[6-7]。韓國學者首次發現NUDT15（nucleoside diphophate-linked moiety X-type motif 15，核苷二磷酸連接的部分X 型基序15）R139C 基因多態性（rs116855232）與白細胞減少密切相關，靈敏度和特異性高達89.4%和93.2%，靈敏度遠高于TPMT的12.1%[8]。隨后中國和日本等亞洲國家的大量學者證實了NUDT15多態性對巰嘌呤類藥物引起的白細胞減少的預測意義[9-10]?！吨袊装Y性腸病治療藥物檢測專家共識意見》建議在有條件的情況下，使用巰唑嘌呤類藥物前可進行NUDT15基因多態性檢測[11]。臨床檢驗中心要求檢驗項目在引入臨床常規實踐前應進行方法學性能評價，基因多態性檢測的方法層出不窮，焦磷酸測序是一種準確性高的方法，但尚無焦磷酸測序檢測NUDT15基因多態性的方法學評價。本文旨在建立焦磷酸測序檢測NUDT15R139C 基因多態性的方法并進行評價，為臨床合理使用巰嘌呤類藥物提供技術指導。

1 材料

1.1 一般資料

隨機挑選在本院進行藥物基因組學檢測人群的EDTA-K2抗凝靜脈全血中提取的基因組DNA（濃度≥20 ng·μL－1，A260/A280在1.8～2.0），倫理批件號：2018NZGKJ-067。

1.2 儀器

A200 基因擴增儀（杭州朗基科學儀器有限公司）；Q24 焦磷酸測序儀（德國QIAGEN 公司）。

1.3 試藥

TakaRa Taq擴增試劑盒（日本Takara 公司）；焦磷酸測序試劑盒（德國QIAGEN 公司）；Streptavidin SepharoseTMHigh Performance（美 國GE Healthcare Life Sciences 公司）；水為蒸餾水。所有引物由上海Invitrogen 公司合成。

2 方法

2.1 PCR 擴增

PCR 反應體系體積為50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol·L－1dNTPs 3 μL，25 mmol·L－1MgCl24 μL，Taq 酶0.25 μL，10 μmol·L－1上下游引物各2 μL，蒸餾水32.75 μL，基因組DNA 1 μL。PCR 反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃/57℃/60℃ 30 s，72℃ 30 s，擴增35 個循環；72℃ 10 min。

2.2 焦磷酸測序

取20 μL PCR 產物與2 μL Sepharose、40 μL binding buffer 和18 μL 蒸餾水混合，振蕩孵育8 min，將其制備成單鏈放在24 孔板中，孔板提前加1 μL 10 μmol·L－1的測序引物和24 μL annealing buffer，85℃解鏈1 min，降溫至室溫，放入焦磷酸測序儀中。核苷酸序列推注順序為“CCTTGT”，其中第一個“C”為野生型信號峰，第二個“C”為CMP 的測序本底，第一個“T”為突變型信號峰，第二個“T”為TMP 的測序本底。根據儀器分析結果或者熒光信號峰的比例判斷型別。

2.3 數據的統計學處理

使用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，兩獨立樣本比較采用雙樣本獨立t檢驗；Hardy-Weinberg平衡檢驗采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 方法建立

從PubMed 數據庫中的SNP 欄中找到NUDT15R139C 的人源基因組序列，利用PyroMark Assay Design 軟件設計出評分最高的兩組引物序列。具體引物序列見表1，共用一條測序引物。挑選一例雜合型基因組DNA 樣本，分別在55℃、57℃和60℃條件下退火，重復檢測7 次。比較不同退火溫度條件下的熒光信號值，發現第一套引物在57℃時信號最高，因此選用第一套引物和57℃退火溫度為NUDT15分型的焦磷酸測序最佳條件（見表2）。

表1 檢測NUDT15 R139C 基因多態性的引物序列Tab 1 Sequence of primers used for genotyping NUDT15 R139C polymorphism

表2 不同條件下焦測序熒光信號值(±s)Tab 2 Fluorescence signals detected by pyrosequencing under different conditions (±s)

表2 不同條件下焦測序熒光信號值(±s)Tab 2 Fluorescence signals detected by pyrosequencing under different conditions (±s)

來源 退火溫度/℃ 熒光信號值 P 值第一套 55 190±10 0.001 57 213±7 －60 197±22 0.114第二套 55 111±8 ＜0.001 57 116±14 ＜0.001 60 113±6 ＜0.001

3.2 靈敏度評價

將NUDT15雜合型DNA 樣本按梯度分別稀釋到10、2 和0.4 ng·μL－1，每管加1 μL 模板，空白管加DNA 溶解液，最低能檢測0.4 ng 基因組DNA（見圖1）。

圖1 不同量NUDT15 雜合型基因組DNA 的檢測結果Fig 1 Detection of different amounts of NUDT15 heterozygote genomic DNA

3.3 準確度評價

由于未檢出NUDT15純突變TT 型，因此隨機挑選經焦磷酸測序驗證的CC 野生型11 例和CT 雜合型9 例，將擴增產物送至華大基因公司Sanger 測序，比較兩種測序方法的結果（見表3）。兩種測序結果符合率100%，焦磷酸測序方法的準確度為100%。將Sanger 測序得到的序列信息經PubMed blast 序列比對后，確定為人源NUDT15基因序列。

表3 焦測序和Sanger 測序檢測NUDT15 基因型的結果比較Tab 3 NUDT15 genotype detected by pyrosequencing and Sanger sequencing

3.4 重復性評價

選取兩種分型的基因組DNA 樣本各1 例，在不同時間點重復檢測3 次，檢測結果完全一致，重復性符合要求。

3.5 臨床樣本檢測

按“3.1”項下最優條件對臨床45 例樣本進行NUDT15分型檢測，共檢出CC野生型33 例（73.3%），CT 雜合型12 例（26.7%），未檢出純突變型樣本，符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。

4 討論

硫唑嘌呤及其衍生物6-巰基嘌呤等嘌呤類藥物作為免疫抑制劑被廣泛用于炎癥性腸病、兒童急性淋巴細胞白血病等治療中，但其致命性的骨髓抑制不良反應限制了其使用[3]。從療效和不良反應來看，嘌呤類藥物的個體間差異大，使患者服用此藥的受益最大化和不良反應最小化十分必要[12]。服藥前的藥物基因組學檢測可優化藥物選擇和劑量并降低不良反應[13]。目前檢測基因多態性的方法有等位基因特異性PCR（AS-PCR）、單鏈構象多態性（SSCP）技術、焦磷酸測序、基于熒光探針的實時PCR 法等，其中AS-PCR 和實時PCR 需要特別設計引物和探針，反應條件很難優化，SSCP 技術受電泳溫度、膠濃度等影響容易造成漏檢，焦磷酸測序作為一種準確性高的方法，邊合成邊測序，能實時獲得核苷酸序列的信息[14-16]，適合投入臨床應用。

江蘇省臨床檢驗中心和國家衛計委提出的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南（試行）》均強調對每個檢測系統在引入常規臨床實踐前應建立性能驗證規范[17]。鑒于目前尚無研究報道關于焦磷酸測序檢測NUDT15R139C 基因多態性的方法學評價，本研究通過考察引物和退火溫度自建焦磷酸測序方法檢測NUDT15R139C基因多態性，并以此為例建立了焦磷酸測序檢測多態性位點的性能評估方案，經驗證靈敏度達0.4 ng 基因組DNA，準確性和重復性均符合要求，能夠投入臨床使用，為個體化使用嘌呤藥物提供臨床支持。