裝載雷公藤甲素的金屬有機骨架材料ZIF-8的制備、表征及優化研究

唐子琰，曾亞文，倪健，2*，董曉旭*（.北京中醫藥大學中藥學院，北京 02488；2.北京中醫藥大學中醫藥研究院，北京 00029）

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）是衛矛科雷公藤屬植物，有清熱解毒、祛風通路、消腫止痛之功，雷公藤甲素是從其中提取的一種環氧二萜內酯化合物，有顯著的抗腫瘤活性[1-2]。但傳統雷公藤甲素制劑水溶性較差、生物利用度低、給藥后被機體迅速吸收并被快速消除導致了其急性毒性的產生[3-4]。近年來，各種納米給藥系統的出現為解決上述問題提供了新思路，如聚合物膠束、脂質體、納米水凝膠以及固體脂質納米粒等[5-6]。但以上載體通常載藥量較低，只適于裝載特定性質的藥物，例如聚合物膠束和固體脂質納米粒適合裝載脂溶性藥物。因此尋找適宜的載藥系統，來實現藥物的高效裝載以及滿足臨床用藥需求是有意義的。

金屬有機骨架材料（MOFs）是一種配位聚合物材料，其由無機金屬離子與有機配體構成，具有結構多樣性、比表面積高、生物相容性好、不飽和金屬配位點多等特點，在吸附[7]、催化[8]、載藥[9]等方面有很大應用前景。沸石型咪唑酯骨架材料（ZIFs）是MOFs 的一種，由過渡金屬原子與有機咪唑類及其衍生物自組裝形成的拓撲結構納米材料。其中ZIF-8 作為ZIFs 典型代表，其有很好的水熱穩定性、化學穩定性，較大的比表面積，較高的pH敏感性，開放的金屬位點，使其在藥物儲存和遞送方面具有廣闊的應用前景。周偉強等[10]的研究中，含硒高分子與ZIF-8 復合材料多級響應釋放藥物分子阿霉素，在低pH 值下阿霉素具有更好的選擇性釋放。曹鑫[11]研究表明，與SM-PGMA 相比，ZIF-8@SM-PGMA 的比表面積從34 m2·g－1提高到172 m2·g－1，平均孔徑從14.24 nm 縮小為5.16 nm，在水溶液中對苯酚的吸附量從23 mg·g－1提高到53 mg·g－1，提高了藥物吸附量，對拓展金屬有機骨架復合材料有意義。劉策等[12]實驗表明，DOX@ZIF-8 在酸性環境中釋放效率明顯快于在中性環境中的釋放效率，呈現出優異的酸響應釋放性能。

基于以上思路，本研究制備金屬有機骨架藥物載體ZIF-8，考察ZIF-8 的不同制備工藝（物理攪拌法，超聲法及水熱合成法），對制備材料的結構和形貌進行表征，并用其裝載雷公藤甲素，確定最佳載藥工藝。

1 儀器與試藥

六水硝酸鋅（純度＞99.99%）、二甲基咪唑（純度＞99%）（阿拉丁試劑上海有限公司）；雷公藤甲素（純度：98%，南通飛宇生物科技有限公司）；甲醇、磷酸（分析純，北京化工廠）；Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；SB-5200 DTD 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XP 26 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SHA-BA恒溫水浴振蕩器（常州市國旺儀器制造有限公司）。

2 方法與結果

2.1 ZIF-8 材料的合成

2.1.1 水熱合成法制備ZIF-8 取Zn（NO3）2·6H2O（1 mmol）和二甲基咪唑（4 mmol），溶解于20 mL 甲醇中，轉移至聚四氟乙烯內襯的高壓反應釜中，單因素考察反應溫度（130、150、170℃）對ZIF-8 合成的影響。反應結束后，冷卻至室溫，離心（10 000 r·min－1，10 min），用甲醇洗滌沉淀，真空干燥（110℃，24 h），即得，計算產率，產率＝產品量/投藥量×100%。

結果顯示，130、150、170℃時ZIF-8 的產率（w%）分別為7.30%、5.50%、25.40%。在170℃時，產品顏色深，可能為原料在高溫下碳化，在使用水熱合成法時溫度應控制在產品無異常顏色變化內。

2.1.2 超聲合成法制備ZIF-8 精密稱取Zn（NO3）2·6H2O（1 mmol）和二甲基咪唑（4 mmol），溶解于20 mL 甲醇中，單因素考察超聲時間（0.5、1、2 h）對ZIF-8 合成的影響。室溫下反應結束后，離心（10 000 r·min－1，10 min），用甲醇洗滌沉淀，真空干燥（110℃，24 h），即得，計算產率。

結果顯示，超聲時間為0.5、1、2 h 時ZIF-8 的產率（w%）分別為11.01%、10.98%、11.94%。結果表明，隨著超聲時間的延長，ZIF-8 產率變化不大，說明在超聲0.5 h 時ZIF-8 就已經基本合成，在之后的時間里處于解體再合成的動態平衡中。

2.1.3 物理攪拌法制備ZIF-8 精密稱取Zn（NO3）2·6H2O（1 mmol）和二甲基咪唑（4 mmol），溶解于20 mL 甲醇中，超聲功率為250 W，置磁力攪拌器反應（600 r·min－1），單因素考察攪拌時間（12、24、48 h）對ZIF-8 合成的影響。室溫下反應結束后，離心（10 000 r·min－1，10 min），用甲醇洗滌沉淀，真空干燥（110℃，24 h），即得，計算產率。

結果顯示，攪拌12、24、48 h 時ZIF-8 的產率（w%）分別為10.66%、10.02%、13.04%，在48 h 時產率最高?？赡茈S著攪拌時間的延長，增加了金屬簇與有機配體接觸的概率，ZIF-8 的產率增加，新生成的小粒子可以在晶體上繼續疊加。

2.2 ZIF-8 材料的表征

2.2.1 X 射線衍射（XRD） 用粉末X 射線衍射測定ZIF-8 晶體的分散狀態和晶體結構。在Cu-Kα（λ＝1.541 nm），高壓40 kV，管流40 mA，掃描速度2°·min－1，2θ＝5～45°條件下進行X-ray 粉末衍射，得到衍射圖譜。

3 種方法制備的ZIF-8 衍射峰均很強，說明材料具有較高的結晶度，由于物理攪拌法和超聲法得到的材料產率較高且較穩定，且材料粉末烘干后無明顯因高溫而產生的焦化現象，故對攪拌法和超聲法的材料進行XRD 表征。結果物理攪拌法攪拌12、24、48 h 時衍射峰無明顯差異；超聲法中超聲30 min、1 h、2 h 衍射峰具有明顯差異，且隨著超聲時間的延長，ZIF-8 特征峰越明顯（見圖1）。與此同時，不同制備方法合成的ZIF-8 的特征峰與模擬的ZIF-8 XRD 圖譜一致，這表明ZIF-8 晶體均已成功合成。

圖1 不同方法合成ZIF-8 的XRD 圖譜Fig 1 XRD patterns of the synthesis of ZIF-8 by different methods

2.2.2 掃描電子顯微鏡（SEM） 精密稱取ZIF-8 材料，用雙碳膠帶固定，在樣品表面噴碳25 min 后，掃描電子顯微鏡下觀察材料形貌特征，記錄SEM 圖譜。

由圖2～4 可知，水熱合成法中隨著反應溫度的上升，ZIF-8 晶體逐漸致密。110 ℃時有大塊狀的晶體；130 ℃時，晶體為規則的立方體，表面平滑整潔。但隨著溫度的上升，在150、170 ℃在晶體表面出現了凹痕和塌陷。溫度過高或者過低都會影響ZIF-8 晶體形貌，適宜的溫度應為130 ℃。超聲法中超聲0.5、1、2 h 制備的ZIF-8 晶體均為立方體，但與水熱合成法和物理攪拌法相比，晶體特征不明顯，周圍分散的尺寸也各異。物理攪拌法制備的ZIF-8 晶體最優，且隨著攪拌時間的延長，晶體越來越立方化，且更加致密。

圖2 水熱合成法不同溫度下合成的ZIF-8 晶體形貌Fig 2 ZIF-8 crystal by hydrothermal synthesis method at different temperature

圖3 超聲法超聲不同時間合成的ZIF-8 晶體形貌Fig 3 ZIF-8 crystal synthesized by ultrasonic method in different time

2.2.3 比表面積儀（BET） 精密稱取ZIF-8 樣品30 mg，置于干燥的樣品管和編號的橡膠塞。對樣品預處理，抽真空、加熱、冷卻。預處理過的樣品垂直插入裝備液氮的比表面積儀，通過Gemini Ⅱ軟件設置參數，測定比表面積。

圖4 物理攪拌法攪拌不同時間合成的ZIF-8 晶體形貌Fig 4 ZIF-8 crystal synthesized by physical stirring method in different time

3 種制備方法制備ZIF-8 MOFs 的比表面積與孔體積有明顯差異，見表1。其中，物理攪拌法制備的ZIF-8 比表面積最大，孔徑適中，可能具備較優的載藥性能，且耗能較低操作步驟較少，綜合XRD 及SEM 的結果，后續研究均采用物理攪拌法制備的ZIF-8。

表1 3 種制備方法合成ZIF-8 的BET 參數Tab 1 BET parameters of ZIF-8 MOFs synthesized by 3 preparation methods

2.2.4 紅外分光光度計（FTIR） 精密稱取ZIF-8 樣品2 mg，加溴化鉀分散，干燥壓片，在4000～500 cm－1范圍內測定IR 光譜。

圖5結果表明：在3130 cm－1和2930 cm－1的吸收振動峰是CH3基團中C-H 鍵的不對稱吸收振動峰，500～1500 cm－1的吸收振動峰歸屬于咪唑環的面內彎曲振動吸收和伸縮振動吸收，其中1150 cm－1和991 cm－1處的吸收峰為咪唑環上的C-N 的伸縮振動峰，說明ZIF-8 材料保留著咪唑環的結構。1580 cm－1的吸收振動峰由C-N 鍵的伸縮振動引起的，420 cm－1處的振動峰是Zn-N鍵的伸縮振動造成的。

圖5 物理攪拌法合成的ZIF-8 的FTIR 圖譜Fig 5 FTIR diagram of ZIF-8 synthesized by physical stirring method in different time

2.3 ZIF-8 裝載雷公藤甲素的研究

2.3.1 雷公藤甲素色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（50∶50），等度洗脫；檢測波長：218 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.3.2 雷公藤甲素線性考察 精密稱取雷公藤甲素10.00 mg，置10 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制得1.00 mg·mL－1的雷公藤甲素母液。另精密量取母液適量，加入甲醇稀釋依次制備成質量濃度為0.5、0.25、0.2、0.1、0.05 mg·mL－1的雷公藤甲素工作溶液。按“2.3.1”項下色譜條件測定峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

雷公藤甲素對照品HPLC 圖譜見圖6。雷公藤甲素的回歸方程為y＝316.18x＋0.0727（R2＝0.9997），表明雷公藤甲素質量濃度在0.05～1.00 mg·mL－1與峰面積線性關系良好。經方法學驗證，儀器精密度、方法重復性、準確度和樣品穩定性均符合含量測定要求。

圖6 雷公藤甲素對照品色譜圖Fig 6 HPLC chromatogram of triptolide

2.3.3 正交優選最佳載藥工藝 稱取適量的ZIF-8 與不同質量濃度的雷公藤甲素溶液，加入甲醇中攪拌反應（600 r·min－1）不同時間，離心（4800 r·min－1，10 min），用甲醇洗滌沉淀2 次，收集上清液進樣檢測雷公藤甲素含量。以載藥量與包封率為指標，篩選最佳載藥工藝。分別考察影響載藥量的三個因素：載藥時間、藥物質量濃度、藥載比，各因素設三個水平，采用L9（3）4試驗設計，因素水平表見表2。載藥量＝（投藥量－上清量）/ZIF-8 總量×100%，包封率＝（投藥量－上清量）/投藥量×100%。

表2 因素水平表Tab 2 Factor level table

表3結果顯示，ZIF-8 載雷公藤甲素最佳工藝為A3B2C3，即載藥時間3 d，藥物濃度6 mg·mL－1，藥載比為5∶12 時，載藥量最高。表4結果表明，載藥量影響因素為C（藥載比）＞B（藥物濃度）＞A（載藥時間），其中藥載比對載藥工藝有顯著影響（P＜0.05）。

表3 雷公藤甲素載藥工藝直觀分析表Tab 3 Orthogonal intuitive analysis of triptolide loading process

表4 載藥工藝方差分析表Tab 4 Variance analysis table of loading process

按優選條件進行3 批樣品驗證，3 批樣品載藥量分別為50.33%、49.16%、50.13%，均值為（49.87±1.26）%，包封率分別為71.31%、69.64%、71.02%，均值為（70.66±1.26）%。表明正交優化的ZIF-8 載雷公藤甲素工藝穩定可行。

3 討論

課題組前期研究發現，當金屬離子（六水合硝酸鋅）與有機配體（2-甲基咪唑）為4∶1 時，以甲醇為溶劑制備ZIF-8 晶體形貌較好，且孔徑較大。3 種方法均可成功制備ZIF-8，但超聲法、水熱合成法制備的晶體形貌不穩定，易受溫度的影響，并伴隨較高的能耗。物理攪拌法制備的ZIF-8 晶體形貌較優且穩定，比表面積最大，利于后續藥物的高效裝載，因此選用物理攪拌法制備ZIF-8 來進行后續載藥研究。

載藥工藝研究中，通過預試驗發現藥載比、藥物濃度和載藥時間為影響載藥量的主要影響因素，因此本文以此為考察對象，設計正交試驗優化最優載藥工藝。結果顯示，最優載藥工藝的載藥量達到（49.87±1.26）%，包封率為（70.66±1.26）%，且載藥工藝穩定可行。