基于網絡藥理學的“海藻-昆布”治療甲狀腺腫的作用機制研究

楊甫臣 張世超

遼寧中醫藥大學附屬醫院沈本醫院骨外科，遼寧本溪 110032

甲狀腺腫是指由多種原因引起的甲狀腺上皮細胞良性增生導致甲狀腺彌漫性或結節性腫大，是臨床上甲狀腺疾病中的常見病。近年來，隨著生活壓力不斷增大，其發病率不斷升高，且女性多于男性[1]。中藥治療甲狀腺疾病歷史悠久且具有很好的效果?！侗静輦湟穂2]中記載：“海藻，瀉熱、軟堅痰、消癭瘤；昆布，功同海藻而少滑，性雄。治水腫癭瘤?！焙Ｔ鍤w肝、胃、腎經，具有軟堅散結、消痰、利水的作用。昆布歸肝、胃、腎經，具有同海藻同樣的功效。臨床上海藻、昆布兩味中藥常相互配伍加減，用于治療甲狀腺類疾病[3-5]。

網絡藥理學是一門在多向藥理學理論和系統生物學理論基礎上分析藥物治療疾病的系統網絡，篩選相關的信號節點，推測藥物的成分、靶點蛋白、代謝通路等的學科[6]。網絡藥理學能全面系統地從多角度揭示藥物對疾病的作用機制[7]。本研究基于網絡藥理學研究方法，從成分、靶點、通路等多角度探討海藻、昆布治療甲狀腺腫的作用機制，為后續研究的開展提供新思路與依據。

1 材料與方法

1.1 海藻、昆布化學成分及靶點的獲取

為了獲得海藻、昆布兩味中藥的化學成分，檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp），并以“口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 以及半衰期（HL）≥4 h”作為篩選條件，選取同時滿足以上條件的作為其主要活性成分。TCMSP 數據庫包含了500 味中藥，中藥成分化合物總計30 069 個，并針對每個化合物提供了OB、DL、藥物HL 等性質評價數據[8]。接著，檢索PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到其化學結構以及Smiles 格式。同時通過Swiss Target Prediction 數據庫（http：//www.swiss-target-prediction.ch/）獲得主要活性成分所對應的相關靶點。通過Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/）統一靶點蛋白的名稱，從而得到海藻、昆布兩味中藥的作用靶點。并將其結果上傳至Cytoscape 軟件，繪制海藻-昆布的主要活性化合物及作用靶點網絡圖。

1.2 中藥-甲狀腺腫相關靶點的搜集與篩選

為了獲得甲狀腺腫的相關疾病靶點，應用Dis GeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）、OMIM（http：//www.omim.org/）及GeneCards（http：//www.genecards.org/）3 個數據庫進行檢索，合并結果，去除假陽性和重復值，得到疾病相關靶點。將海藻、昆布成分作用靶點和甲狀腺腫相關的疾病靶點利用R 軟件（https：//cran.r-project.org/mirrors.html）進行映射構建韋恩圖，篩選出中藥-疾病的共同靶點。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡構建與核心靶點篩選

應用String 數據庫（https：//string-db.org/）對上述篩選得到的共同靶點構建PPI 網絡模型，其中種類設為“Homo sapiens”，“highest confidence”＞0.9，構建PPI網絡，并下載保存TSV 格式文件。同時導入Cytoscape軟件中，基于Network Analyse 功能分析其網絡。并篩選節點度值（Degree）分布和介數中心性（Betweenness centrality）均在中位數以上的作為“核心靶點”。Degree和Betweenness centrality 是判斷網絡節點重要性的拓撲參數，其值與節點的重要性成正比。

1.4 GO-BP 生物功能注釋及KEGG 通路分析

利用Metascape 軟件（http：//metascape.org/，version 3.0）對上述得到的核心靶點進行GO-BP 生物功能和KEGG Pathway 富集分析，將研究物種設置為“Homo sapiens”，以此獲得海藻、昆布治療甲狀腺腫的生物學功能及KEGG 信號通路。將靶點基因、GO-BP 生物功能、KEGG 信號通路導入Cytoscape 軟件，繪制核心靶點-生物功能-信號通路圖。

2 結果

2.1 海藻-昆布主要活性化合物及靶點的篩選

通過在TCMSP 數據庫中檢索并篩選中藥的活性成分，共收集得到活性化合物海藻4 個、昆布6 個。將其Smiles 格式上傳到Swiss Target Prediction，篩選出作用靶點海藻225 個、昆布145 個。通過匯總兩味中藥的作用靶點并刪除重復值，最終得到兩味藥共有靶點305 個。應用Cytoscape 軟件繪制海藻-昆布的主要活性化合物及作用靶點網絡圖。見圖1。

2.2 中藥與甲狀腺腫共同作用靶點

通過檢索DisGeNET、OMIM 及GeneCards 數據庫獲得1162 個甲狀腺腫的相關靶點。將305 個中藥的共有作用靶點與1162 個甲狀腺腫相關靶點輸入R軟件繪制韋恩圖，取交集后獲得中藥與疾病共同作用靶點70 個。見圖2。

2.3 PPI 網絡與核心靶點分析

利用String 數據庫構建上述共同作用靶點的PPI網絡圖，見圖3。圖中共有節點70 個，邊119 條。通過Cytoscape 軟件對網絡中所有節點的拓撲參數（Degree和Betweenness centrality）進行分析篩選，即Degree≥4，Betweenness centrality≥3.30×10-3。共得到核心靶點25 個，包括磷脂酰肌醇3-激酶1（PIK3R1）、p53 基因（TP53）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）、轉甲狀腺素蛋白（TTR）等。

圖2 中藥與疾病共同作用靶點韋恩圖

2.4 核心靶點生物功能富集分析與KEGG 通路分析

將篩選出的中藥-疾病核心靶點導入Metascape軟件分別進行GO-BP 生物學功能和KEGG 通路富集分析。結果顯示，海藻、昆布兩味中藥主要通過調控細胞蛋白定位、細胞有絲分裂周期的G1/S 轉變、氮化合物的合成、激素刺激和酸性化學物質的反應及MAPK級聯和蛋白激酶B 信號傳導等生物學過程，以及p53、黏著斑、白細胞跨內皮遷移、神經營養蛋白、ErbB、VEGF、Jak-STAT 等信號通路發揮治療甲狀腺腫的作用。見圖4 和圖5。并通過Cytoscape 軟件構建核心靶點-生物功能-信號通路網絡圖。見圖6。

3 討論

中醫理論中并無甲狀腺腫疾病的概念，根據主要臨床特征，認為其屬于“癭病”范疇?！锻饪普嬖彙吩疲骸鞍`瘤多外因六邪，營衛氣血凝郁?！盵9]中醫認為氣滯、痰凝、血瘀結于頸部是本病的基本病機，多采用理氣化痰、消癭散結的方法進行治療，如海藻玉壺湯、消瘰丸等，其方中均含有海藻、昆布兩味中藥?！渡褶r本草經》中首次提出應用含碘中藥海藻用于治療本病，海藻中含有多糖、脂肪酸等多種活性成分，在《神農本草經》中首次提出應用其可治療癭病[10-11]?，F代藥理學研究表明其具有抗菌抗炎、抗腫瘤和抗氧化的作用[12-13]。昆布主要活性成分昆布多糖、多酚、蛋白質及纖維素等，具有調血脂、降血糖和血壓、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學作用[14-16]?！都斡颖静荨分姓撌隼ゲ嫉墓πЭ梢浴叭グ`行水，下氣化痰”。目前臨床研究發現，海藻、昆布加減治療甲狀腺結節具有很好的效果。

圖3 海藻-昆布治療甲狀腺腫的PPI 網絡

圖4 海藻-昆布治療甲狀腺腫的GO-BP 生物學功能

圖5 海藻-昆布治療甲狀腺腫的KEGG 信號通路

本研究篩選得到海藻活性成分包括二甘醇二苯甲酸酯、異巖藻糖甾醇、β-谷甾醇等；昆布活性成分包括24-亞甲基膽甾醇、花生四烯酸、巖藻甾醇等，并得到海藻作用靶點225 個、昆布145 個，與甲狀腺腫靶點取交集后得到共有靶點70 個。通過構建PPI 網絡以篩選得到25 個核心靶點，包括TP53、PIK3R1、AKT1、APP、TTR 等。p53 基因是一種細胞生長的重要調節因子，具有在DNA 復制水平上調節細胞正常生長的功能。沈育鋒等[17]研究發現，其在結節性甲狀腺腫合并甲狀腺癌患者中的表達明顯增加，是一種特異性標志。PIK3R1、AKT1 是PI3K/AKT 信號通路的重要組成部分，具有調控細胞增殖與凋亡的作用，同時可以加速細胞周期，促進細胞增殖并抑制凋亡。目前多項研究發現，PI3K/AKT 信號通路在甲狀腺腫病變中異常激活[18-19]。APP 是一種淀粉樣蛋白前體蛋白基因，其與血清三碘甲腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）的表達密切相關，在APP/PS1 轉基因小鼠體內，血清T4水平升高，而T3水平下降[20]。而TTR 蛋白主要在肝臟中合成，具有轉運甲狀腺素的作用。

GO-BP 生物學功能富集分析結果顯示，海藻、昆布兩味中藥主要通過調控細胞蛋白定位、細胞有絲分裂周期的G1/S 轉變、氮化合物的合成、激素刺激和酸性化學物質的反應以及MAPK 級聯和蛋白激酶B 信號傳導等生物學過程發揮作用。KEGG 通路富集分析結果顯示，其主要通過p53、黏著斑、白細胞跨內皮遷移、神經營養蛋白信號、ErbB、VEGF、Jak-STAT 等信號通路發揮作用。已有研究表明，甲狀腺激素可通過激活p53、MAPK 等從而調控其下游基因表達[21]。VEGF信號通路可調節生理性及病理性血管生成過程，誘導內皮細胞的增殖、分裂和遷移，促進新血管的生成，修復病變血管內膜。VEGF 主要在甲狀腺濾泡細胞內合成。目前多項研究表明，在甲狀腺腫患者的甲狀腺組織及血清中VEGF 均有較高水平的表達[22-24]。Jak-STAT 信號通路可調節細胞因子信號轉導，其主要參與介導人體缺氧、缺血以及氧化應激等多種應激反應。有研究發現，高甲狀腺激素可激活Jak-STAT 信號通路，從而進一步發揮其作用[25-26]。

圖6 海藻-昆布治療甲狀腺腫的核心靶點-GO-BP 生物功能-KEGG 信號通路互作網絡圖

本研究通過網絡藥理學的研究方法初步闡明了海藻及昆布從多成分、多靶點、多通路治療甲狀腺腫的作用機制，為其今后研究提供思路和依據。鑒于網絡藥理學技術的局限性，后期仍需要相應的實驗研究加以驗證。