瑪咖多糖的提取條件及體外活性研究

馮 康，李愛民,，吳曉磊，高曉冬，李子杰,*

(1.江南大學 生物工程學院/糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2.新時代健康產業(集團)有限公司，北京 102206)

瑪咖(LepidiummeyeniiWalp.)原產于南美海拔3 500 m以上的安第斯山區，是葉子橢圓、根莖形似小圓蘿卜的十字花科獨行菜屬一年生草本植物，又稱印加蘿卜?，斂I養成分豐富，因在秘魯具有悠久的栽種歷史，所以有“秘魯人參”“南美人參”的美譽。我國于2003年引種成功，如今在云南和新疆等地已形成了一定規模的種植產業?，斂Ф嗵堑奶崛」に囉卸喾N，包括熱水浸提、超聲波輔助浸提以及微波輔助浸提等。鄭朋朋等[1]采用熱水浸提的方式對瑪咖多糖的提取率進行優化，在提取溫度82 ℃下提取率達到9.6%。郝利民等[2]優化熱水浸提瑪咖多糖，提取率達到了15.9%，但提取溫度高達100 ℃。研究表明：提取溫度會對多糖的結構和生物活性產生影響，多糖在高溫提取會發生部分降解，分子質量減少，并且多糖的抗氧化活性也會下降。浦躍武等[3]等通過比較超聲波、微波和熱水浸提這三種提取方式，發現超聲波提取的效果最好，微波次之，熱水浸提效果最差。超聲波輔助熱水浸提可以降低提取溫度、減少提取時間[4]。

瑪咖多糖具有抗疲勞[5-6]、抗腫瘤、調節免疫能力、調節內分泌等諸多功效[7-11]，且毒性很小，作為功能性食品有很好的開發前景。目前對瑪咖多糖的活性研究多集中在抗疲勞和抗氧化活性方面，對其降血脂的功效鮮有研究。本研究采用超聲波輔助熱水浸提的方式對瑪咖多糖的提取條件進行優化，降低了提取溫度，減少了提取時間；同時本研究利用體外實驗研究其可能的降血脂功效，以期為瑪咖多糖產品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料瑪咖使用的是瑪咖根部，采于2017年云南香格里拉地區，自然晾干直至實驗。

淀粉酶(384 U/mL)、糖化酶(300 U/mL)，諾維信(中國)生物技術有限公司；考來烯胺，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、氯仿、正丁醇為分析純，苯酚為試劑純，國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼[2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH]，質量分數為97%，TCI(上海)化成工業發展有限公司；鄰二氮菲(質量分數為99%)、?；悄懰徕c(質量分數為97%)、甘氨膽酸鈉(質量分數為98%)、糠醛溶液(質量分數99%)、胰蛋白酶(250 U/mg)，Adamas試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SB25- 12DTDN型超聲波清洗機，寧波新芝生物有限公司；HL- 2型恒流蠕動泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；DEAE- 650M型離子交換柱、HW- 65F型葡聚糖凝膠柱，日本TOSOH株式會社；BIO- RAD iMark型酶標儀，美國伯樂公司;FD- 1000型冷凍干燥機、N- 1100型旋轉蒸發儀，日本東京理化器械株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1瑪咖多糖的提取

1.3.1.1 提取方法

將瑪咖根切塊、打碎成粉，過100目篩，制成瑪咖粉，取50 g瑪咖粉按一定比例與蒸餾水混合，超聲波輔助熱水浸提，過濾得到瑪咖水提物，減壓濃縮至250 mL；在瑪咖水提液中加入2 mL淀粉酶，60 ℃下反應3 h后加入2 mL糖化酶，60 ℃下反應2 h，100 ℃加熱10 min使酶滅活，離心取上清液；向上清液中加入3倍體積無水乙醇，在體積分數為75%乙醇水溶液、4 ℃下醇沉12 h，將沉淀物用蒸餾水復溶；采用Sevag法對復溶液反復多次操作以去除蛋白；將去除淀粉和蛋白的水提溶液凍干，得到瑪咖粗多糖(maca crude polysaccharides,MCP)。

1.3.1.2 提取率的測定

先用苯酚硫酸法測定總糖含量(以葡萄糖計)，并通過換算因子測定瑪咖多糖的提取率。

標準曲線的繪制：準確稱取葡萄糖20 mg于100 mL容量瓶用重蒸H2O定容，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL葡萄糖母液至試管中，補加水至2 mL，再依次加入1 mL 質量分數為6%的苯酚水溶液和5 mL濃硫酸，振蕩10 min，靜置10 min顯色，于490 nm處測吸光度，以葡萄糖質量濃度ρ葡(mg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

換算因子F的計算見式(1)。

(1)

式(1)中，m1為瑪咖多糖質量，mg；ρm為瑪咖多糖的總糖質量濃度(以葡萄糖計)，mg/mL;D為稀釋倍數。

瑪咖多糖提取率計算見式(2)。

(2)

式(2)中，w為瑪咖多糖提取率；m2為瑪咖干粉質量，mg；ρm為瑪咖多糖的總糖質量濃度(以葡萄糖計)，mg/mL;D為稀釋倍數；F為換算因子。

1.3.1.3 響應面試驗設計

根據Box- Behnken中心組合試驗設計原理，采用4因素3水平的三元二次響應面分析方法，優化瑪咖根多糖的提取工藝。在前期單因素試驗的基礎上，自變量的試驗水平分別以-1、0、1進行編碼(見表1)，共設計29個實驗點，中心實驗重復5次，用來估計試驗誤差。

表1 瑪咖多糖提取條件的響應面試驗設計因素和水平Tab.1 Response surface methodology factors and levels of maca polysaccharide extraction condition

1.3.2瑪咖多糖的組分分離

取200 mg瑪咖粗多糖，溶于2 mL重蒸H2O，以1 mL/min的洗脫速度通過陰離子交換柱DEAE- 650M分離，先用重蒸H2O洗脫，待中性多糖全部收集之后，再用氯化鈉水溶液濃度梯度(0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L)洗脫。每管中多糖的含量用苯酚硫酸法測定，將含有多糖的試管收集，50 ℃旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥得到樣品。對冷凍干燥的樣品再次用葡聚糖凝膠柱(HW- 65F)分離，采用重蒸H2O洗脫達到脫鹽純化的目的，將含有多糖的樣品旋轉蒸發濃縮、冷凍干燥，得到純化后的多糖樣品。

1.3.3體外抗氧化活性實驗

以維生素C(Vc)作為陽性對照，葡萄糖(Glc)作為陰性對照進行抗氧化活性的對比。

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性的測定

取0.5 mL不同質量濃度(1、2、4、6、8、10 mg/mL)的樣品與0.5 mL DPPH(0.04 mg/mL，溶于無水甲醇)混合，充分振蕩并室溫靜置40 min，在517 nm處測定吸光度。

(3)

式(3)中，A1表示用無水甲醇代替樣品的吸光度，A2表示用無水甲醇代替DPPH溶液的吸光度，A3表示DPPH溶液和樣品混合反應后的吸光度。

1.3.3.2 羥自由基清除活性的測定

取0.5 mL不同質量濃度(1、2、4、6、8、10 mg/mL)的樣品水溶液與0.5 mL硫酸亞鐵水溶液(6 mmol/L)以及1 mL H2O2(6 mmol/L)混勻，靜置10 min，再加入0.5 mL水楊酸溶液(6 mmol/L)，混勻，靜置30 min，在510 nm處測定吸光度。

(4)

式(4)中，A4表示不添加樣品的吸光度；A5表示添加樣品反應后的吸光度。

1.3.4體外降血脂活性實驗

瑪咖多糖組分體外降血脂活性測定根據文獻報道的方法并作適當修改[12-13]。分別取1 mL不同濃度的?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉標準品溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L)于具塞試管中，加入1 mL質量分數為0.25%的現配糠醛水溶液，混勻，冰浴5 min，加入5 mL 質量分數為70%的H2SO4水溶液于70 ℃水浴10 min，取出冰浴2 min，在510 nm處測定吸光度。以膽酸鹽濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪得膽酸鹽濃度標準曲線，根據標準曲線計算樣液中膽酸鹽的濃度。膽酸鹽結合實驗流程見圖1，在具塞試管中加入20 mg的多糖粉末，加入1 mL 0.01 mol/L HCl溶液，充分混勻，37 ℃振蕩消化1 h用來模擬胃消化，然后用0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH值至6.3，然后加入2 mL 10 mg/mL的胰蛋白酶，混勻后37 ℃孵育1 h來模擬小腸消化。分別加入2 mL 0.5 mmol/L甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c水溶液混勻，37 ℃振蕩1 h，用3 kDa超濾管4 000 r/min離心30 min。如果多糖與膽酸鹽結合，透過液中為未與多糖結合的膽酸鹽，測定透過液中的膽酸鹽濃度，即可得出多糖與膽酸鹽的結合率。取1 mL透過液于具塞試管中，加入1 mL質量分數為0.25%的現配糠醛水溶液，混勻，冰浴5 min，加入5 mL質量分數為70%的H2SO4水溶液于70 ℃水浴10 min，取出冰浴2 min，在510 nm處測定透過液吸光度。以葡萄糖作為陰性對照，以考來烯胺為陽性對照，按考來烯胺的結合率為100%，計算各種多糖對膽酸鈉鹽的結合率。

圖1 瑪咖多糖膽酸鹽結合實驗流程Fig.1 Procedure for binding ability experiment of maca polysaccharide cholate

1.4 統計分析

響應面試驗設計和分析采用Design-Expert 10軟件。其余實驗數據采用“平均值±標準差”的方式表示，采用Prism 8.0軟件做數據處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 瑪咖多糖提取條件的優化

2.1.1響應面試驗結果

Zhang等[14]在研究不同溫度對桑葚多糖結構和功能的影響時發現30 ℃提取時，多糖分子質量為536.45 kDa，而90 ℃下分子質量只有110.23 kDa，且低溫提取的多糖顯示出比高溫提取更好的抗氧化活性。項浩特等[15]研究了溫度和時間對瑪咖多糖提取效率的影響，發現在70 ℃以上隨著溫度和時間的增加，提取率不斷降低。因此，本研究選擇采用超聲波輔助熱水浸提的方式提取多糖，并用響應面法優化提取率。采用Design-Expert 10 軟件設計實驗方案，見表2。根據此實驗方案，按照1.3.1.1節的方法提取瑪咖多糖，并用苯酚硫酸法測定多糖含量，提取率見表2。

表2 瑪咖多糖提取條件的響應面試驗結果Tab.2 Results of response surface experiment of maca polysaccharide extraction conditions

2.1.2響應面模型擬合分析

2.1.3各因素交互作用分析

各因素的交互作用對瑪咖多糖提取率的等高線與響應面見圖2。從等高線可以看出兩個因素之間的交互作用的強弱，等高線越圓相互作用越弱，等高線橢圓形越明顯，相互作用越強[16]。從響應面曲線可以看出各因素對響應值(即瑪咖多糖提取率)的影響程度，曲面越陡，影響程度越大、越平坦，影響程度就越小[17]。從4個因素相互作用中選出3個代表性的結果，對比圖2(a)與圖2(b)，可以發現溫度與時間的交互作用比溫度與超聲功率的交互作用更強，從圖2(c)可以看出料液比對瑪咖多糖提取率的影響程度比時間大。

圖2 各因素的交互作用對瑪咖多糖提取率的影響Fig.2 Interaction of different factors on extraction rate of mace polysaccharide

通過軟件Design-Expert 10分析，得到較佳的提取條件為提取溫度50.23 ℃、超聲功率217.74 W、提取時間42.35 min、料液比1∶32.34 g/mL，理論提取率為11.86%，考慮到實際提取的方便性，將各因素的值修正為提取溫度50 ℃、超聲功率220 W、提取時間42 min，料液比1∶32 g/mL，最后得到的實際瑪咖多糖提取率為11.0%，與理論預測值接近。

2.2 瑪咖多糖的組分分離結果

采用陰離子交換柱DEAE- 650M對瑪咖多糖各組分進行分離，用苯酚硫酸法測定每管中多糖的濃度，見圖3。固定洗脫速度為1 mL/min，先用重蒸H2O洗脫，得到含量最多的中性瑪咖多糖1(maca polysaccharides 1,MPS1)，再用氯化鈉濃度梯度洗脫，在0.1 mol/L NaCl和0.2 mol/L NaCl水溶液下分別分離得到2個含量較少組分，分別命名為瑪咖多糖2(maca polysaccharides 2,MPS2)和瑪咖多糖3(maca polysaccharides 3,MPS3)。之后，對MPS1、MPS2和MPS3進行再次純化并去除其中的NaCl，如將含有MPS1的試管匯總后冷凍干燥，用1 mL重蒸H2O復溶，用葡聚糖凝膠柱HW- 65F進行再次純化，收集匯總純化后的MPS1，再次冷凍干燥，最后得到MPS1多糖樣品。

圖3 瑪咖粗多糖組分分離Fig.3 Separated fractions of maca crude polysaccharide

2.3 瑪咖多糖體外抗氧化活性分析

2.3.1DPPH自由基清除效果分析

瑪咖多糖對DPPH自由基清除率見圖4，由圖4可以看出隨著多糖濃度的增加，3種多糖對DPPH自由基的清除效果都呈現出上升的趨勢，其中，MPS1對DPPH自由基清除效果最佳，在5 mg/mL的濃度下，基本達到了較佳清除率81.8%。MPS2在超過5 mg/mL后清除效果有明顯的增加，在10 mg/mL的濃度下清除效果也達到了63.7%。此外，粗多糖MCP在3 mg/mL濃度以下時清除率低于MPS1，之后清除率與MPS1基本持平，在5 mg/mL的濃度下達到較佳清除率83.9%，MCP和MPS1的半數抑制濃度(IC50)分別為2.411 mg/mL和2.339 mg/mL。MCP中MPS1占到絕大部分，MCP的清除率與MPS1類似，說明MPS1組分是起到DPPH自由基清除的主要原因。維生素C在0.001～0.005 mg/mL質量濃度下對DPPH自由基清除效果隨著濃度提高急劇提升，從35.8%提高到81.6%，在1 mg/mL質量濃度達到較佳清除率99%，MCP、MPS1和MPS2的清除效果均低于維生素C。

圖4 瑪咖多糖的DPPH自由基清除效果Fig.4 Scavenging effect of DPPH radical of maca polysaccharide

2.3.2羥基自由基清除效果分析

瑪咖多糖對羥基自由基清除率見圖5，由圖5可以看出MCP、MPS1和MPS2對羥自由基均有較好的清除效果，隨著多糖濃度的提高，對羥自由基的清除率也有所提高。其中MCP在10 mg/mL的質量濃度下清除率達到了73.3%，半數抑制濃度(IC50)為2.388 mg/mL。MPS2在10 mg/mL時清除率達到了76.7%，MPS1的清除效果隨著濃度增大變化不大，在1 mg/mL時達到39.8%，高于MCP和MPS2，10 mg/mL時清除率達到56.8%，而MPS3對羥基自由基沒有清除效果，在各個濃度下清除率均與陰性對照組相似。

圖5 瑪咖多糖的羥基自由基清除效果Fig.5 Scavenging effect of hydroxyl radical of maca polysaccharide

2.4 瑪咖多糖體外降血脂活性分析

肝臟內的膽固醇降解成膽汁酸排入腸道，其中95%的膽汁酸會通過重吸收經門靜脈返回肝臟，形成結合膽汁酸并再次排入腸道，此過程為肝腸循環[18]。膽汁酸對維持人體內膽固醇的平衡起到至關重要的作用，一旦阻礙了膽汁酸的肝腸循環，肝臟就會通過降解更多的膽固醇來彌補膽汁酸的缺失，這就使得血液中的膽固醇流入肝臟，起到了降血脂的作用[19]。而甘氨膽酸和?；悄懰峋鶎儆诮Y合型初級膽汁酸，常與鈉離子或鉀離子結合形成結合型初級膽汁酸鹽，這是膽汁酸的主要存在形式。多糖類物質降血脂的主要原理是在溶液中形成網狀結構，能在小腸中夠吸附住膽汁酸，阻止膽汁酸重吸收。

瑪咖多糖對2種膽酸鹽的結合率見圖6，由圖6可以看出，與陰性組對比，4種多糖對?；悄懰徕c的結合均有顯著性，但只有MCP和MPS3對甘氨膽酸鈉的結合有顯著性差異(P<0.05)。以考來烯胺為陽性對照，MPS3在體外對2種膽酸鈉鹽的結合能力最好，對?；悄懰徕c的結合率為49.1%，對甘氨膽酸鈉的結合率為32.3%，造成兩種膽酸鈉鹽結合能力不一致的原因可能與兩種膽酸鈉的分子結構有關，?；悄懰徕c的分子質量比甘氨膽酸鈉更大，更易被溶于水后形成網狀結構的MPS包裹結合。同時，橫向比較4種多糖，可以推測MPS3形成的網狀結構可能更加緊密。

圖6 瑪咖多糖對膽酸鈉鹽的結合能力Fig.6 Binding capacity of maca polysaccharide toward sodium cholate

3 結 論

研究采用超聲波輔助熱水浸提的方法，響應面優化之后得到較佳的提取條件為提取溫度50 ℃、超聲功率220 W、提取時間42 min，料液比1∶32 g/mL，最后得到的實際瑪咖多糖提取率為11.0%。MCP、MPS1和 MPS2具有較強的抗氧化活性，對DPPH自由基的較佳清除率分別為83.9%、81.8%和63.7%，對羥基自由基的較佳清除率分別為73.3%、56.8%和76.7%；MPS3雖然沒有抗氧化活性，但是在體外對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結合率分別達到了49.1%和32.3%，推測瑪咖多糖可能會通過吸附結合膽酸鈉鹽的方式，減少肝腸循環，從而具有降低血脂的活性。