柑橘香橙素生成途徑關鍵酶黃烷酮-3-羥化酶特性分析及原核表達

黃 旭，田苗苗，肖妃垚，劉 娟，王 振，單 楊

(湖南大學 隆平分院，湖南 長沙 410082；湖南省農業科學院 農產品加工研究所/果蔬貯藏加工與質量安全湖南省重點實驗室/湖南省果蔬加工與質量安全國際科技創新合作基地，湖南 長沙 410125)

類黃酮是柑橘中最重要的一類生物活性成分，包括黃烷醇、黃酮、黃烷酮、黃酮醇、二氫黃酮醇和花色苷[1]，具有促進健康的功能，如：抗炎、抗癌、抗氧化等[2]。作為類黃酮化合物中的一類，二氫黃酮醇通常在柑橘等植物液泡中以糖苷衍生物的形式存在[3]。獲取二氫黃酮醇的方法主要是提取法和合成法。提取法包括溶劑提取法、超聲提取法和酶解法[4]等，合成法[5]包括化學合成法和生物催化合成法[6]等。提取法和化學合成法雖然發展成熟但仍存在化學物質殘留、副產物過多等不利因素[7]。近年來，生物催化合成的方法以廉價底物合成高價值的目的產物越來越受到人們廣泛關注。借助于微生物進行改造后生產天然產物能夠不受季節限制，還具有反應溫和、選擇性強等優點，對生產高附加值食品及保健品等原料具有極大優勢[8]。

黃烷酮-3-羥化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)能夠催化黃烷酮類化合物柚皮素在C- 3位置立體定向羥基化，合成二氫黃酮醇香橙素(見圖1)，是黃酮醇化合物和花色苷生物代謝途徑上的關鍵酶之一[9]。

圖1 柚皮素在黃烷酮-3-羥化酶的作用下合成香橙素的路線Fig.1 Aromadendrin synthesis pathway from naringenin catalyzed by flavanone-3-hydroxylase

Forkmann等[10]在紫羅蘭中首次發現F3H并對其酶活性和純化鑒定進行了報道，在后續研究中發現在酶催化反應過程中也同樣需要氧氣、酮戊二酸鹽、亞鐵離子和抗壞血酸作為輔助因子[11]。有重組蛋白研究發現不同種類的F3H還具有不同范圍的底物偏好性和催化活性[2]。而f3h在金魚草[12]中首次克隆成功后，在擬南芥[13]、草莓[14]、茄子[15]、百合[16]中也陸續被發現。本研究選取了在NCBI上進行注冊的5種F3H，利用生物信息學的分析方法對酶的理化性質、蛋白質結構、基因序列等進行比較與總結并構建異源表達體系進行原核表達，以期對香橙素生成途徑F3H的酶學特征進行了解，從而總結不同物種之間的f3h基因多樣性和多態性，以利于日后利用原核生物進行生物合成類黃酮化合物，也為后續進一步改造f3h基因工程菌提供材料。

1 材料與方法

1.1 數據采集

將目前在NCBI上已注冊的F3H進行篩選，最終選取了5種已注冊的F3H作為研究對象(見表1)，分別是來源于柑橘的CF3H(GQ121373.1)、陸地棉的GhF3H(EF187440.1)、玉米的ZmF3H(U04434.1)、水母雪蓮的SmF3H(AY550120.1)以及歐芹的PcF3H(AY230248.1)。并從NCBI數據庫中獲取了核酸序列及蛋白質序列。所選取的不同來源的F3H均是完整序列。

表1 不同物種的F3HTab.1 F3H of different species

1.2 菌株和試劑

質粒pET32a- GhF3H，pET32a- CF3H，pET32a- PcF3H，pET32a- SmF3H和pET32a- ZmF3H由上海生工公司合成，E.coliBL21購于上海生工公司。SDS- PAGE凝膠制備試劑盒、LB液體培養基購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白Marker，美國Thermo公司；IPTG購自上海瑞永生物科技公司；α-酮戊二酸購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；FeSO4·7H2O，購自上海滬試試劑公司；柚皮素，分析純，上海麥克林生化科技有限公司，柚皮素、香橙素，質量分數≥98%，上海源葉生物科技有限公司。其余試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

LDZM- 80L- Ⅲ型高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；JY96- IIN型超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；SYNERGY H1型酶標儀，美國Bio Tek公司；H- class型超高效液相色譜儀，美國Waters公司；qtof6550型質譜儀，美國安捷倫公司；Mini- PROTEAN Tetra Cell 1658004型蛋白電泳儀，美國Bio- Rad公司；Avanti J- 26XP型離心機，美國Beckman公司。

1.4 實驗方法

1.4.1利用生物信息對酶篩選

1.4.1.1 基本理化性質

通過expasy工具包中的ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)[17]以及NCBI提供的ORFfinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)[18]分析,可獲得氨基酸數(aa)、分子質量(kDa)、等電點、不穩定系數、脂肪指數以及開放閱讀框長度等理化分析信息；通過expasy工具包中ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)工具在線預測F3H親疏水性；通過網站(http:∥biotech.ou.edu/)可在假設該蛋白質在原核表達體系過表達的前提下，預測此蛋白質在大腸桿菌中溶解的可能性[19]。

1.4.1.2 保守功能域結果分析，跨膜結構及信號肽分析

通過NCBI網站中提供的工具Conserved Domains(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線分析鑒定出蛋白質序列包括的保守結構域[20]，用TMHMM v.2.0軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對酶的跨膜螺旋狀態進行預測[21]；利用Signal 4.0軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 4.0/)能預測在原核生物的氨基酸序列中信號肽位點是否存在及位置信息[22]。

1.4.1.3 蛋白質二、三級結構及配體結合位點分析

利用在線軟件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白二級結構[23]?？紤]到序列相似度≥30%，使用SWISS-MODEL軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)同源性建模來預測蛋白質三級結構[24]，對不同來源的F3H進行蛋白二級結構和三級結構的分析；通過COACH在線軟件(https:∥zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COACH/)[25-26]進行蛋白質- 配體結合位點預測，從而預測配體的結合位點，進行蛋白信息分析。

1.4.1.4 序列比對分析

對所有物種來源的F3H序列用ClustalX 2.1及DNAMAN 8進行多重序列比對來研究一組序列的關系。

1.4.2重組菌株培養條件

將質粒pET32a與篩選出的酶基因序列經雙酶切后進行連接重組為pET32a- F3H。將pET32a- GhF3H，pET32a- CF3H，pET32a- PcF3H，pET32a- SmF3H和pET32a- ZmF3H質粒分別轉入EscherichiacoliBL21中后獲得對應的5株重組菌株。將其涂布在含有氨芐的LB固體培養基，在37 ℃培養箱中放置10 h后觀察菌株生長情況，挑取其中生長狀況良好的單菌落，重新接種在含有氨芐的LB液體培養基中，培養至菌株濃度OD值約為0.6時，以V(菌液)∶V(體積分數為60%的甘油水溶液)=1∶1分裝在凍存管中，保存在-80 ℃冰箱。

1.4.3重組pET32a- F3H質粒誘導表達

取5株重組目的菌株各20 μL分別裝于3 mL含100 μg/mL氨芐的LB液體培養基中，在37 ℃，220 r/min的搖床中進行活化，過夜培養約10 h后取200 μL菌液接種于30 mL含有氨芐的LB液體培養基中進行擴大培養，當OD值在0.7～0.8時加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導劑IPTG進行低溫誘導，在23 ℃，220 r/min的搖床中培養24 h后收集菌體，用PBS溶液重懸后進行破碎，分別收集勻漿液及上清液，SDS- PAGE檢測重組pET32a- F3H。

1.4.4重組菌株發酵液處理

在誘導后的菌液中添加終濃度為100 mg/L的柚皮素和FeSO4(終濃度為0.1 mmol/L)以及α-酮戊二酸(終濃度為8.2 mmol/L)，必要時可添加少量抗壞血酸。在23 ℃，220 r/min搖床中繼續培養24 h后取不同菌株的發酵液轉移至15 mL離心管，將發酵液超聲破碎后加入等體積乙酸乙酯萃取，靜置后在3 700 r/min，4 ℃，10 min條件下離心，取上層有機相進行氮吹，待有機相揮發完全后加入1 mL甲醇復溶，將得到的溶解液經0.22 μm濾膜過濾后轉移至液相瓶，用HPLC進行分析。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析

2.1.1基本理化性質分析結果

來自5種不同物種的f3h分析，分析結果見表2。由表2可知，5種f3h基本理化性質具有一定規律性。其基因開放閱讀框(ORF)為1 032～1 119 bp，編碼的氨基酸長度基本在343～372個，蛋白分子質量為38.89～41.45 kDa，理論等電點在5.43～5.96，偏酸性。蛋白質的穩定系數不統一，其中只有GhF3H是穩定蛋白，穩定指數在38.86。剩余全部為不穩定蛋白，不穩定指數在40.01～46.60。脂肪指數指的是脂肪族氨基酸占蛋白質的相對含量，比例在77.52～83.68，說明其熱穩定性較好。

表2 不同物種的F3H基本理化信息Tab.2 Basic physicochemical information of F3H in different species

ProtScale結果分析見表3，5種F3H蛋白親疏水性預測結果全部為親水性蛋白質，且親水性范圍在為-0.297～-0.464。預測蛋白親疏水性有助于后期蛋白的表達、純化的研究，尤其是在蛋白質純化方法上可提供良好的參考。

繼續分析5種F3H蛋白在正常生長溫度下在大腸桿菌中可能的過表達蛋白的溶解度，基本分為低中高三類。溶解度可能性見圖2，其中PcF3H和SmF3H預測可能是不溶蛋白，有成為包涵體的可能性；CF3H蛋白溶解度較低為2.90%；ZmF3H蛋白溶解度處于中等為70.20%；最后具有極高溶解度的GhF3H為99.60%。

圖2 F3H蛋白在E.coli BL21體內的溶解可能性Fig.2 Dissolution possibility of F3H protein in E.coli BL21

2.1.2保守功能域結果分析

結構域作為蛋白質生理功能的基礎獨立功能區域[27]，保守的結構域能顯示一組不變或相同的序列結構域。分析結果顯示，選取的5種F3H都具有典型的2OG- Fe- Oxy保守結構域(2OG- Fe(II)加氧酶超家族包含2-氧戊二酸酯(2OG)和Fe(II)依賴性加氧酶超家族)以及PcbC結構域(次級代謝產物的生物合成，轉運和分解代謝)，這表明：它們都具有同樣的催化功能且在反應時需要氧戊二酸，亞鐵離子及氧氣等輔因子參與。除去SmF3H(AY550120.1)之外全部屬于PLN02515，PcbC，2OG- Fe- OXY家族。SmF3H屬于PLN02639氧化還原酶家族。

2.1.3跨膜結構結果分析

預測結果表明：來自不同物種的5種酶均為膜外蛋白，不含有膜及跨膜結構，由此推測，F3H蛋白在細胞質基質中合成后不經過跨膜轉運，并在細胞質中催化合成類黃酮類物質。

2.1.4蛋白質信號肽結果分析

信號肽一般是由15～30個氨基酸殘基形成的短肽鏈，可以引導蛋白質跨膜運輸[28]。在宿主菌中表達外源蛋白時，可用信號肽引導外源蛋白定位分泌到胞外，提高蛋白可溶性。通過分析發現5種F3H蛋白均未發現具有信號肽，表明此類蛋白不屬于分泌蛋白[28]，可能在胞內進行酶促反應。

2.1.5蛋白質二三級結構及配體結合位點分析結果分析

經SOPMA預測F3H蛋白的二級結構組成，發現他們的二級結構包括α-螺旋，延伸鏈，β-折疊和無規則卷曲，結果見圖3。由圖3可知，他們之間各有差異但是總體具有一定的相似性：F3H 蛋白中無規則卷曲和α-螺旋所占比例最多，β-折疊所占比例最少。在F3H二級結構中，α-螺旋占31.99%～38.59%，β-折疊占4.35%～6.18%，延伸鏈占17.12%～18.82%，剩下則是無規則卷曲部分。

圖3 不同物種F3H蛋白的二級結構組成Fig.3 Secondary structure composition of F3H protein in different species

按照序列最大相似度進行建模的蛋白三級結構圖結果見圖4，經分析比對5種F3H蛋白活性位點發現：雖然5種F3H結合位點各不相同，但也具有一定相似性。其中鐵離子及氧戊二酸結合位點主要在蛋白三級結構延伸鏈上，其中鐵離子結合位點可能在220位及280位氨基酸殘基附近，氧戊二酸結合位點可能在200位、219位和290位氨基酸殘基附近；而黃酮類化合物結合位點在α螺旋和延伸鏈上都存在，可能結合在221位及290位氨基酸殘基附近。

圖4 不同物種F3H蛋白的三級結構組成Fig.4 Tertiary structure of F3H protein in different species

2.1.6序列比對結果分析

通過比對結果發現所分析5種不同物種的F3H蛋白具有一定的相似性見圖5，相似度為72.07%。不同物種來源的F3H在某些區域具有極高相似度，具有高度保守性的部分區域如281～293與蛋白質結構域預測結果位置相近，推測可能是結構域所在對應位點，這也能夠表明：F3H保守結構域的部分氨基酸序列組成具有一定的同源性。

圖5 不同物種F3H序列比對結果Fig.5 Results of different F3H sequence alignment

2.2 重組pET32a- F3H表達結果

經雙酶切后將5種F3H分別與pET32a載體進行重組結合，分別誘導培養含有PcF3H、ZmF3H、CF3H、GhF3H和SmF3H的菌株，經SDS- PAGE鑒定在大腸桿菌中的表達結果見圖6。圖6的1～7通道分別是Marker、pET32a空載體、表達CF3H菌株、表達GhF3H菌株、表達ZmF3H菌株、SmF3H菌株和表達PcF3H菌株破碎后的上清液。

如圖可知與空載相比，5個外源導入的f3h基因在70 kDa處都有明顯蛋白質特征條帶，且新條帶與5種目標蛋白在大腸桿菌體內總分子質量基本一致。說明CF3H、GhF3H、ZmF3H、SmF3H和PcF3H在大腸桿菌中成功實現了表達，屬于胞內可溶蛋白。其中CF3H、GhF3H和PcF3H有較亮的條帶出現，蛋白表達量高，但有部分水解情況產生；ZmF3H和SmF3H相比來說有較細條帶，蛋白表達量較少。

泳道中1～7分別是Marker，pET32a空載體、CF3H、GhF3H、ZmF3H、SmF3H和PcF3H的破胞上清液。圖6 SDS- PAGE分析大腸桿菌破碎后上清液的蛋白Fig.6 SDS- PAGE analysis of extracted proteins from the homogenate after the disruption of E.coli BL21

2.3 重組pET32a- F3H產物檢測分析

對重組菌株進行發酵培養后上樣進行HPLC檢測分析(圖7)。經過分析后發現除SmF3H外,其余4種重組菌均在圖譜中出現了兩個與柚皮素、香橙素標準品出峰位置一致的峰且分離效果較好。為進一步驗證產物，將發酵液進行一級質譜(100～1 000m/z)掃描，MS結果顯示在負離子模式下化合物峰在m/z=287.058 7時有離子峰，與香橙素標準品相同，證明大腸桿菌能夠成功表達蛋白并將柚皮素轉化為香橙素?？傻贸鼋Y論，大腸桿菌能夠體內表達F3H蛋白并能以柚皮素為底物合成香橙素?？蛰dE.coliBL21和5種異源表達的菌株產香橙素情況見圖8，其中ZmF3H香橙素合成量最高為20.12 mg/L，而PcF3H、GhF3H和CF3H的合成量分別為17.48、19.34、15.45 mg/L。

圖8 不同菌株催化合成香橙素產量Fig.8 Yield of aromadendrin catalyzed by different bacterial strains

由圖6和圖7對比可知，ZmF3H蛋白表達量較小但催化合成香橙素產率較高，說明其蛋白活性較高。推測SmF3H組樣品未能檢測到目標峰可能是來源于水母雪蓮的F3H在結構域亞組與其余F3H不同，因此雖然SDS- PAGE顯示成功出現蛋白表達，但在酶促反應中未能成功與黃酮化合物底物結合從而轉化為香橙素，后續可針對此方面進一步進行探討。

圖7 不同重組菌株產酶催化合成香橙素的HPLCFig.7 HPLC for synthesis of aromadendrin by enzyme from different recombinant strains

3 結 論

香橙素在化合物植物體中的代謝通路已經明晰，本研究選取5種來自不同物種的F3H進行研究，對他們各自的理化性質，空間結構以及同源性進行了分析并構建了異源表達體系。分析認為：不同來源的黃烷酮-3-羥化酶具有相近的開放閱讀框及氨基酸長度，分子質量在38.89～41.45 kDa。蛋白偏酸性，適合在中酸性環境下的反應；預測所有的黃烷酮-3-羥化酶都是親水性蛋白且蛋白的溶解可能性差異較大，但后續實驗發現所選的5種F3H蛋白均屬于可溶性蛋白；具有2OG- Fe- Oxy，PcbC及PLN02515結構域的黃烷酮-3-羥化酶能作用于黃酮類化合物催化羥基化且在酶催化反應過程中需要鐵離子，氧戊二酸及氧氣等輔因子的參與；黃烷酮-3-羥化酶的蛋白二級結構中α螺旋和無規則卷曲占得比例最多，占整體結構的70%以上；5個不同物種的黃烷酮-3-羥化酶氨基酸序列相似度為72.07%，有一定的同源性。

對選取的5種不同物種來源的F3H蛋白進行原核表達，經過大腸桿菌表達后進行SDS- PAGE發現，與空載組相比PcF3H、ZmF3H、CF3H、GhF3H和SmF3H均出現了新蛋白條帶，說明選擇的外源F3H在大腸桿菌中成功實現蛋白表達；進行發酵培養后，除SmF3H外，4種其他來源的F3H均在液相色譜及質譜中確定了有新產物香橙素的生成。推測不同物種的黃烷酮-3-羥化酶有相似的結合位點，但由于結合的位點不同，因此在反應過程中催化效果不一，導致底物的偏好性及合成量的不同，具體酶學性質及催化產香橙素的應用后期還需進一步探討研究。