湖南常見辣椒品種游離氨基酸主成分分析及綜合評價

葛 帥，王蓉蓉，*，王穎瑞，葉美玲，覃業優，丁勝華，周 輝，蔣立文，鄧放明

(1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.鹽津鋪子食品股份有限公司，湖南 長沙 410000；3.長沙壇壇香調料食品有限公司，湖南 長沙 410128；4.湖南省農業科學院農產品加工研究所，湖南 長沙 410125)

辣椒(CapsicumannuumL.)屬茄科一年生或有限多年生草本植物[1]。2018年全球辣椒種植面積約199萬ha，年產量3 677萬t，其產值和效益不斷增加[2]。辣椒中富含辣椒素、維生素C、多酚等多種成分，具有抗菌、除濕、祛寒等功效[3]。辣椒品種眾多，湖南本地市售主要為大紅椒、青尖椒、螺絲椒、小米椒、小紅椒、大青椒等。由于不同品種在諸多品質方面存在較大差異，因此明確不同品種辣椒的理化品質，對辣椒資源的合理開發及利用具有重要意義。

游離氨基酸(free amino acid，FAA)是一種重要的活性物質，且作為重要呈味物質能豐富食品的味覺層次，并參與風味物質的合成。因此，FAA種類和含量的測定對評價食品營養及品質具有重要意義[4-7]。目前，關于食品中FAA的研究主要集中在獼猴桃[8]、荔枝[9]、橄欖[10]、黃花菜[11]、百合[5]、蟲草[12]等方面。結果表明，FAA品質受種植地域環境、品種、取樣部位等諸多因素的影響。辣椒作為深受大眾喜愛的調味品，目前關于其FAA的研究仍較少。Cuadra-Crespo等[13]分析了甜椒貯藏過程中FAA的變化，共檢出12種FAA，且低溫(5 ℃)貯藏對其影響較小。然而，關于不同品種辣椒中FAA品質及呈味氨基酸的比較研究仍然較少。

主成分分析(principal component analysis,PCA)是一種多元統計分析方法，能通過降低數據維度，在損失較少原始數據信息的前提下將多個變量轉化為幾個不相關的綜合變量[14-15]。目前，主成分分析已廣泛應用于食品中FAA的品質評價，如桑椹[16]、獼猴桃[8]、百合[5]等，較好地體現了不同品種及取樣部位的品質差異。因此，主成分分析是評價FAA品質的有效手段。

本研究采用高效液相色譜- 串聯質譜法(HPLC-MS/MS)對湖南常見6種辣椒的FAA進行比較分析，并運用主成分分析和綜合評價法比較不同品種辣椒的FAA品質，隨后采用聚類分析對其進行相關性分析及分類，明確不同品種辣椒中FAA的品質差異，以期為辣椒資源的合理開發與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大紅椒(湘研805，DH)、螺絲椒(旋妃，LS)、小紅椒(飛艷，XH)、大青椒(珍黃100，DQ)，產地均為湖南省長沙市；青尖椒(湘辣712，QJ)和小米椒(美艷，XM)，產地為湖南省寧鄉市。

氨基酸(纈氨酸Val、蘇氨酸Thr、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe、甲硫氨酸Met、亮氨酸Leu、賴氨酸Lys、異亮氨酸Ile、組氨酸His、精氨酸Arg、絲氨酸Ser、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly、谷氨酰胺Gln、谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp、酪氨酸Tyr、丙氨酸Ala、γ-氨基丁酸GABA、瓜氨酸Cit、鳥氨酸Orn、胱氨酸Cys-Cys、天冬酰胺Asn、羥脯氨酸Hpro、?；撬酺an、半胱氨酸Cys)標準品，色譜純，北京拜爾迪生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

LGJ- 25G型冷凍干燥機，北京四環福瑞科儀科技發展有限公司；DE- 50g型萬能粉碎機，浙江紅景天工貿有限公司；TG16K- Ⅱ型臺式高速離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司；LC- 20A型高效液相色譜儀、LCMS- 8045型三重四極桿質譜儀，島津儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品制備

挑選成熟度一致、大小均一、顏色均勻、無病蟲害和機械損傷的辣椒作為實驗材料，每個品種取3份。將辣椒洗凈、瀝干、去蒂后，剩余的部分切碎，保留辣椒籽，置于真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，冷阱溫度-50 ℃，絕對壓力30 Pa，自動程序干燥48 h。隨后將凍干樣品粉碎后裝入鋁箔袋抽真空包裝，于-20 ℃中保藏備用。

1.3.2氨基酸的提取

參考王馨雨等[5]的方法，精確稱量各品種的凍干樣品0.100 0 g，分別置于50 mL離心管中，加入20 mL超純水室溫下超聲(250 W，450 kHz)提取30 min，隨后8 000 r/min離心15 min，提取上清液于100 mL容量瓶中，重復3次，定容后取適量溶液過0.22 μm水系微孔濾膜得待測液。

1.3.3標準混合溶液的制備

精確稱取干燥至恒重的各氨基酸標準品適量，加入體積分數10%甲醇，配制成混合標準品儲備液于4 ℃下保存。取不同體積的儲備液稀釋后，制成系列濃度的混合標準品溶液，進行線性關系分析。

1.3.4氨基酸組成分析

色譜條件：色譜柱為Shim-pack GIST-HP C18 (2.1 mm×100 mm×3 μm)；流動相A為水- 體積分數0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈- 體積分數0.1%甲酸溶液，流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

質譜條件：離子化模式為ESI+，掃描方式為多反應檢測(MRM)，霧化器流量3.0 L/min，加熱氣流量10 L/min，碰撞氣為氬氣，干燥氣流量10.0 L/min，加熱塊溫度400 ℃，DL管溫度250 ℃。26種氨基酸標準品色譜如圖1。

圖1 26 種氨基酸標準品HPLC-MS/MS色譜 Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of 26 standard amino acids

1.4 數據處理

根據HPLC-MS/MS內置數據庫對各氨基酸進行定性定量分析，其含量用mg/g(以干質量計)表示；運用Excel繪制不同品種辣椒FAA組成模式圖；味道強度值(taste active value,TAV)為氨基酸含量與其呈味閾值之比；運用Origin 2017繪制呈味氨基酸組成模式圖及PCA得分圖和載荷圖；運用Origin 2017 Heat Map with Dendrogram繪制聚類熱圖；運用IBM SPSS Statistics 23軟件進行相關性分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種辣椒FAA組成及含量分析

基于HPLC-MS/MS建立了26種氨基酸的測定方法，通過該方法在6種辣椒中共檢出24種FAA，包括纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、賴氨酸和異亮氨酸8種必需氨基酸(essential amino acid，EAA)，組氨酸和精氨酸2種半必需氨基酸(semi-essential amino acid，SEAA)，色氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、鳥氨酸、胱氨酸、天冬酰胺、羥脯氨酸14種非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)。Cuadra-Crespo等[13]通過超高液相色譜- 串聯質譜法對5 ℃貯藏條件下的甜椒進行分析，共檢測出12種FAA，較本研究少檢出谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、鳥氨酸、天冬酰胺和羥脯氨酸，分析原因可能是原料品種和處理方式的差異。

6種辣椒都包含23種FAA，但其組成種類具有一定的差異性，見表1。相比其他3個品種，QJ、LS、DQ未檢出胱氨酸，而DH、XM、XH未檢出羥脯氨酸。與其他FAA相比，天冬酰胺質量分數最高，為1.72～6.92 mg/g；其次為谷氨酰胺，為1.23～2.59 mg/g(見圖2)。此外，天冬氨酸(5%～9%)、絲氨酸(5%～10%)、γ-氨基丁酸(2%～8%)、賴氨酸(3%～5%)在6個品種辣椒中也占有較高的比例，且它們中的部分氨基酸還具有特殊生理功能，如天冬氨酸既是重要的呈味氨基酸(delicious amino acid，DAA)，也是一種良好的營養補充劑，具有調節腦神經代謝、治療心臟病和高血壓等功效[17]；γ-氨基丁酸藥用價值較高，具有舒緩情緒、輔助降血壓等功效[18-19]；賴氨酸具有促進生長發育和鈣吸收等功效，并與人體免疫功能相關[20]，可見辣椒的藥用價值有待進一步開發。整體來看，6個品種辣椒總游離氨基酸(total free amino acid，TFAA)質量分數在7.28～19.36 mg/g，其中DH的TFAA含量最高，幾乎為LS的3倍，且除DH中未檢出羥脯氨酸和含量差異較小的絲氨酸和鳥氨酸外，其余各FAA含量均顯著(P<0.05)高于LS。QJ與XH相比，TFAA質量分數幾乎相同，約為12.00 mg/g，但QJ中必需氨基酸比例略高于XH，呈味氨基酸比例小于XH，一定程度上說明XH相比QJ呈味效果更好。各品種間羥脯氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、精氨酸變異系數較高，表明其含量差異較大；而鳥氨酸和胱氨酸變異系數較低，表明其含量差異很小?？傮w而言，6個品種辣椒所含FAA種類基本一致，但含量差異較大。

表1 不同品種辣椒FAA組成Tab.1 Composition of FAAs in different peppers

2.2 不同品種辣椒呈味氨基酸分析

FAA作為重要的呈味物質能提供鮮味、甜味、苦味等味覺，豐富了食品的味覺層次。根據侯娜等[21]的呈味氨基酸分類及氨基酸呈味特性，將氨基酸劃分為鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸)、甜味氨基酸(蘇氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸)、苦味氨基酸(甲硫氨酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸)。辣椒中呈味氨基酸含量從高到低依次為鮮味、甜味、苦味、芳香族氨基酸，見圖3。鮮味氨基酸質量分數在1.41～2.88 mg/g，可見辣椒作為調味品主要賦予食品鮮味，其中DH(2.88 mg/g)、DQ(2.82 mg/g)、XM(2.63 mg/g)鮮味氨基酸質量分數較為突出。甜味氨基酸質量分數為1.22～3.01 mg/g，XM甜味氨基酸含量最高卻未呈現較明顯的甜味，推測其較高含量的辣椒素掩蓋了甜味氨基酸的呈味作用[22]；DH除具有突出的鮮味外也具有較高含量的甜味氨基酸?？辔栋被豳|量分數為0.87～2.60 mg/g，不同品種辣椒間差異較大，DH含量最高，LS含量最低。芳香族氨基酸質量分數為0.32～0.87 mg/g，相比于其他3類呈味氨基酸，其在各品種辣椒中含量均較低。對比6種辣椒鮮味、甜味、苦味氨基酸含量發現，辣椒各類呈味氨基酸含量互有高低，但通常鮮味和甜味氨基酸含量高的辣椒，其苦味氨基酸含量也較高，這也可通過圖2直觀反映。由此可見，不同品種辣椒中各類呈味氨基酸組成比例類似，在各類氨基酸相互調和下，不同品種辣椒都呈現出相似且較為統一的呈味特點。

圖2 不同品種辣椒FAA組成模式分析Fig.2 FAAs composition analysis of different peppers

圖3 不同品種辣椒呈味氨基酸組成模式分析Fig.3 Delicious amino acids composition analysis of different peppers

由于各氨基酸有不同的呈味閾值，單從含量上無法準確分析呈味氨基酸對辣椒風味的貢獻，故引入TAV對辣椒呈味氨基酸進行評價，見表2。當TAV>1時，表明該呈味氨基酸對風味貢獻大，且數值越大呈味作用越明顯；當TAV<1時，表明該呈味氨基酸對風味貢獻小，呈味作用不明顯[23-24]。鮮味氨基酸中對風味貢獻大的分別為谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸。相比于其他品種辣椒，DH中谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸 TAV均大于1；XM中谷氨酸TAV最高，而閾值較低，呈味作用顯著，其含量高低直接決定食品的鮮美程度；DQ中天冬氨酸對鮮味貢獻最大，常被作為一種鮮味劑，與呈味核苷酸并用，在發達國家中逐漸代替味精使用[11]。甜味氨基酸中，對風味貢獻大的為組氨酸，其在DH和XM中TAV均大于1，分別為1.52和1.31，呈現出更顯著的甜味特點?？辔栋被嶂?，精氨酸和纈氨酸對風味貢獻較大，且這2種氨基酸藥用價值也較高，具有調節血糖的功能[4,25]。其中，甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸在各品種辣椒中TAV均小于1，可有效增強其他呈味氨基酸的鮮味和甜味[26]。芳香族氨基酸中，胱氨酸在DH、XM和XH中呈味貢獻最大，其TAV均大于6；而苯丙氨酸和酪氨酸TAV都低于1，呈味作用不明顯?？傮w而言，辣椒中鮮味氨基酸TAV較甜味、苦味氨基酸高，鮮味特征顯著，符合辣椒的呈味特點，其中XM、DH鮮味最為突出，甜味和苦味能一定程度上起到協調風味的作用。

表2 不同品種辣椒呈味氨基酸TAV分析Tab.2 TAV analysis of delicious amino acids of different peppers

2.3 不同品種辣椒FAA相關性分析

對6種辣椒的24種FAA成分進行相關性分析，氨基酸相關系數矩陣如表3。由表3可知，大部分氨基酸含量間呈正相關，部分氨基酸含量間還呈極顯著正相關，如蘇氨酸與苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺呈極顯著正相關(P<0.01)；苯丙氨酸與脯氨酸、組氨酸、天冬酰胺呈極顯著正相關(P<0.01)；亮氨酸與異亮氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸呈極顯著正相關(P<0.01)；組氨酸與甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺呈極顯著正相關(P<0.01)等。大多數氨基酸間的相關系數絕對值大于0.3，表明各氨基酸間的相關性較強，即可以通過主成分分析對各品種辣椒的FAA進一步分析。

表3 FAA相關系數矩陣Tab.3 Correlation coefficient matrix of FAAs

2.4 不同品種辣椒FAA主成分分析

經主成分分析共提取4個主成分，其中主成分1貢獻率最大(59.837%)，表明主成分1對辣椒品質的影響最大，見表4。前3個主成分特征值均大于1，其累計貢獻率高達92.496%，說明前3個主成分基本可反映不同品種辣椒FAA的大部分信息，故選取前3個主成分作為數據分析的有效成分。

表4 主成分的特征值和貢獻率Tab.4 Eigenvalue and their contribution of principal components

前3個主成分的特征向量與載荷矩陣如表5，載荷值反映了各FAA與主成分間的相關系數，載荷值的絕對值越大，表明該氨基酸對主成分影響越大，正號表示對主成分正向影響，負號表示對主成分負向影響[11,16]。由表5可知，天冬酰胺、亮氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、谷氨酸、色氨酸、絲氨酸對主成分1貢獻最大，其中天冬酰胺、亮氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸載荷值均大于0.9，且呈顯著正相關。主成分2中，羥脯氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、丙氨酸、天冬氨酸貢獻最大。然而，主成分3中鳥氨酸的載荷值為-0.855，對主成分呈負相關。

表5 主成分的特征向量與載荷矩陣Tab.5 Eigenvectors and loading matrix of principal components

不同品種辣椒PCA分析見圖4。如圖4(a)可知，各種辣椒較好地分散在不同區域，兩點間距離越長表明相關性越低，兩者品質特性差異越大，距離越短說明相關性越高，兩者間品質差異越小[27]。根據各點的分布情況與距離關系，大致劃分為3個區域。其中，DQ、QJ分布于第一、二象限，LS、XH分布于第三象限，XM、DH分布于第四象限，聚集在同一區域表示兩品種間品質較為接近。由圖4(b)可知，一些氨基酸的信息在主成分分析過程中丟失，箭頭的長度反映了信息的丟失程度，箭頭越短丟失的信息越多[28]，同時也反映了各氨基酸在其主成分中載荷值的大小。如谷氨酸、色氨酸、絲氨酸、鳥氨酸信息損失較多，其在主成分1中載荷值較小，但總體上大部分氨基酸的信息在主成分分析中都得到較完整的保留，表明主成分分析是一種非?？煽康臄道斫y計分析方法。此外，FAA主要集中在第一、四象限，如谷氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸和纈氨酸等集中在第四象限，表明這些氨基酸對XM和DH貢獻大，且其在XM和DH中都有最高的含量，推測這些氨基酸與XM和DH的品質相關。第二象限中僅有羥脯氨酸和γ-氨基丁酸，它們對PC1呈負向影響，而其他氨基酸均對PC1呈正向影響。

圖4 不同品種辣椒的PCAFig.4 PCA of different peppers

2.5 不同品種辣椒FAA的綜合評價

由表4可知，前3個主成分的特征值均大于1，且累計貢獻率高達92.496%，通常認為累計貢獻率高于85%，即可描述整體水平并可提取主成分構建綜合評價模型[14]，因此提取前3個主成分代替24種FAA指標對FAA進行分析。根據主成分的特征向量得到辣椒中FAA的前3個主成分線性關系為：

F1=0.262X1+0.260X2+0.259X3+
0.256X4+…+0.103X21+0.120X22+
0.146X23+0.110X24；
F2=-0.009X1+0.026X2-0.043X3+

0.099X4+…+0.378X21+0.319X22+

0.268X23-0.033X24；

F3=0.021X1-0.069X2+0.031X3-
0.040X4+…-0.149X21+0.309X22-
0.242X23-0.520X24。

由于任何單一主成分都無法代表辣椒中總游離氨基酸的水平，故以各主成分對應的貢獻率作為權重，對3個主成分加權求和，得到辣椒中FAA綜合評價表達式：F=0.647F1+0.231F2+0.122F3。通過表達式計算得到各品種辣椒得分如表6，得分越高，表明該辣椒FAA綜合品質越好。由表6可知，第一、二、三主成分得分最高的分別為DH、DQ、XM，說明這些組分分別對DH、DQ、XM的FAA品質影響最大。根據總分情況得到各辣椒的FAA品質排名，從高到低依次為DH、XM、DQ、QJ、XH、LS，表明各辣椒間的FAA品質存在較大差異。其中DH和XM得分均大于2，品質較好；LS得分最低，為-3.862，品質最差。

表6 不同品種辣椒的成分得分和綜合評估Tab.6 Principal component scores and comprehensive scores of different peppers

2.6 不同品種辣椒FAA聚類分析

為進一步分析各品種辣椒中FAA，采用ward最小方差和歐式距離法對數據進行聚類分析。聚類分析是一種能對大量的數據進行歸類的多元統計法，并能通過可視化圖形直接反映樣品的相關程度。不同品種辣椒熱圖聚類如圖5，原始數據經過標準化處理，圖5中色塊顏色深淺表示氨基酸含量的高低，橫向為各品種辣椒的聚類，縱向為FAA的聚類，聚為同類的表示兩者相關程度高，歐式距離越短表示相關程度越高。從各品種辣椒聚類結果來看，6種辣椒被分為3類，分別是XH與LS、DQ與QJ、XM與DH，其中DQ與QJ相關程度最高，表明DQ與QJ品質較為接近。被聚為同類的辣椒在FAA總含量及綜合得分上均較為相近，聚類結果也與PCA結果一致，表明聚類結果準確可靠。從各FAA聚類結果來看，大致可將其分為5類：第1類氨基酸為纈氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和丙氨酸，其主要為呈味氨基酸，故被歸為一類；第2類為蘇氨酸、天冬酰胺、組氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸，其為第一主成分主要貢獻氨基酸；第3類為γ-氨基丁酸、瓜氨酸、羥脯氨酸，其均為非呈味氨基酸和第二主成分主要貢獻氨基酸；第4類為胱氨酸和鳥氨酸，其在辣椒中含量較低；第5類為色氨酸與谷氨酸，其在XM中均具有較高的含量，都為呈味氨基酸和第一主成分主要貢獻氨基酸。這些氨基酸中，蘇氨酸和天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺、亮氨酸和異亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸呈現較強的相關性，與表3相關系數矩陣結果一致。

圖5 不同品種辣椒聚類分析Fig.5 Cluster analysis of different peppers

3 結 論

基于高效液相色譜- 串聯質譜建立了26種氨基酸的測定方法，通過該方法共檢出湖南常見辣椒DH、QJ、LS、XM、XH、DQ中24種FAA，包括8種必需氨基酸、2種半必需氨基酸、14種非必需氨基酸。不同品種辣椒FAA組分存在一定差異，QJ、LS和DQ中未檢出胱氨酸，而DH、XM和XH中未檢出羥脯氨酸。相比于其他FAA，天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、γ-氨基丁酸、賴氨酸在各辣椒中質量分數均較高，其分別達到1.72～6.92、1.23～2.59、0.67～1.43、0.74～1.30、0.40～0.95、0.32～0.76 mg/g。不同品種辣椒TFAA質量分數在7.28～19.36 mg/g，其中DH的TFAA含量最高，LS含量最低。部分藥用氨基酸，如天冬氨酸、γ-氨基丁酸、賴氨酸在各品種辣椒中都具有較高的含量，表明辣椒具有潛在的藥用開發價值。辣椒中呈味氨基酸含量從高到低依次為鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、芳香族氨基酸。通過TAV分析發現，鮮味氨基酸是辣椒的主要呈味氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸對鮮味貢獻較大，DH與XM較其他品種辣椒鮮味更為突出，更具風味價值，而其他呈味氨基酸起到協調風味的作用。通過聚類分析發現DH與XM、DQ與QJ、XH與LS品質較為接近，部分氨基酸，如蘇氨酸與天冬酰胺、精氨酸與谷氨酰胺、亮氨酸與異亮氨酸、苯丙氨酸與脯氨酸呈現較強的相關性。由主成分分析及綜合評價發現，DH、XM、DQ中FAA品質優于QJ、XH、LS。