煙酰胺對紫色紅曲菌生長和次級代謝產物合成的影響

張 函，張 楠，朱倩倩，王海蛟，石嘉辰，張 嬋，2,*，王成濤,2

(1.北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048)

紅曲菌是我國常用的藥食兩用絲狀真菌之一，應用歷史已有近千年[1]。紅曲菌可產生多種次級代謝產物[2-5]，其中，研究較多的3種次級代謝產物為Monacolin K、紅曲色素、桔霉素，均為聚酮類化合物。紅曲色素是由多種色素組成的可食用天然色素，著色性能好，廣泛應用于食品著色行業[6]。桔霉素是一種真菌毒素，有一定的腎毒性，限制了紅曲產品在食品醫藥領域的工業化應用[7]。

Monacolin K通過競爭性抑制效應降低HMG-CoA還原酶的活性，從而阻礙膽固醇合成[8-9]。Monacolin K可被人體直接利用，應用前景良好[10]。但目前Monacolin K產量低、成本高，實現Monacolin K高產主要通過發酵條件優化、培養基組成優化[11]、誘變育種、基因工程[12]等手段。

煙酰胺是煙酸的酰胺化合物，和煙酸均是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的前驅物[13-14]。Huang等[15]的研究發現，向紅曲菌培養基中加入甘油后，通過多組學分析，發現ATP合成酶的表達量增加，泛醌氧化還原酶(NADH)在呼吸鏈中起重要作用，這些蛋白質協同作用于乙酰CoA的生物合成。

實驗室前期利用非靶向代謝組學，分析添加谷氨酸與未添加谷氨酸的發酵液樣本第8天的代謝組信息，篩選出與聚酮類化合物相關的差異代謝物共12種，其中10種可能與Monacolin K的合成相關。朱倩倩等[16]通過向紅曲菌原發酵培養基中添加精氨酸等10種差異代謝物，發現不同質量分數的煙酰胺對Monacolin K有不同的顯著影響，低質量分數具有促進作用，而質量分數過高則表現為抑制作用，添加量為質量分數0.5%時，對Monacolin K產量提高具有較佳效果。本研究通過分析煙酰胺對紅曲菌生物量、pH值、菌絲形態、紅曲色素含量和Monacolin K含量的影響，進一步研究煙酰胺對與紅曲菌Monacolin K合成相關基因表達的影響，從而探究作為差異代謝物的煙酰胺是如何影響紅曲菌次級代謝產物的合成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型紫色紅曲菌MonascuspurpureusM1菌株，由北京市食品添加劑工程技術研究中心保存。

PDA培養基、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、豆粕粉、NaNO3、MgSO4·7H2O、蛋白胨、KH2PO4、ZnSO4·7H2O、甘油、0.22 μm濾器、一次性注射器、甲醇(色譜純)、乙醇(分析純)等，北京半夏科技發展有限公司；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Monacolin K標準品 (純度≥98%)，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

20A型超高效液相色譜儀、SPD-M20A型紫外檢測器、UV-2450型紫外- 可見光分光光度計，日本島津公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；M-pact AX124型分析天平，上海歡奧科技公司；超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；PCR擴增儀，德國Biometra公司；NanoDrop 2000型核酸定量儀，Thermo公司；CFX96型實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；SU8010型掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養基制備

固體培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨3、酵母浸粉4、麥芽浸粉20、瓊脂20、KH2PO42、NaNO32、MgSO4·7H2O 1 。

液體種子培養基(g/L)：葡萄糖30、甘油70、豆粕粉15、蛋白胨10、KH2PO42、NaNO32、MgSO4·7H2O 1 。

對照組發酵培養基(g/L) ：甘油90、ZnSO4·7H2O 2、大米粉20、KH2PO42.5、蛋白胨10、NaNO35、MgSO4·7H2O 1。

實驗組發酵培養基(g/L)[16]：在對照組發酵培養基的基礎上添加質量分數0.5%的煙酰胺。

1.3.2菌種培養

M1菌株在固體培養基上活化2代，取適量菌液接種到種子培養基中，30 ℃、200 r/min培養2 d，按10%的接種量將種子液分別接種到對照組和實驗組發酵培養基中，30 ℃、150 r/min培養2 d，25 ℃、150 r/min培養13 d。

分別收集紅曲菌第2、5、8、12、15天發酵液，置于2 mL無菌離心管中，12 000 r/min離心10 min，去上清液，用滅菌超純水重懸，反復3～4次，最后盡量吸除剩余水分，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3Monacolin K含量測定

取5 mL發酵液，向其中加入15 mL體積分數75%的甲醇，超聲波萃取30 min，靜置過夜，用注射器吸取1 mL左右的樣品，經0.22 μm濾膜處理，打進液相小瓶，留待檢測。參照文獻[17]，利用HPLC檢測發酵液中Monacolin K的含量。

色譜條件：色譜柱InertsilODS-3 C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)，流動相為甲醇和質量分數0.1%磷酸(體積比3∶1)，總流速1 mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測溫度30 ℃，檢測波長237 nm，進樣量10 μL。

1.3.4紅曲色素色價測定

取5 mL發酵液，向其中加入15 mL體積分數70%的乙醇，于60 ℃恒溫水浴1 h，4 000 r/min離心15 min。用紫外分光光度計測定410、448、505 nm處的吸光度[18]，紅曲色素色價(U/mL)計算見式(1)。

紅曲色素色價= 吸光度 × 稀釋倍數 。

(1)

1.3.5菌絲體生物量和pH值的測定

采用干重法測定菌絲體生物量。取5 mL發酵液用3層紗布過濾，再用蒸餾水洗滌2～3次，擰干水分，在60 ℃烘箱中烘干至恒重,稱質量[19]，生物量計算見式(2)。

生物量=w(干物質)/V(發酵液) 。

(2)

式(2)中，生物量，g/L；w(干物質)，g；V(發酵液)，L。

用pH計測定不同發酵液pH值，每個樣品重復測定3次，結果以平均值表示。

1.3.6菌絲體形態檢測

培養8 d的紅曲菌發酵液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入體積分數2.5%戊二醛溶液(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋)，吸打混勻，常溫靜置12 h。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗細胞2次，重懸離心2次，棄上清液。依次用不同體積分數的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、100%)重懸，每種體積分數靜置10 min后12 000 r/min離心5 min，棄上清液，每種體積分數重復2次。分別用醋酸異戊酯與乙醇(體積比=1∶1)、純醋酸異戊酯溶液對細胞進行乙醇置換，在每種溶劑中分別靜置10 min后，12 000 r/min離心5 min，棄上清液。最后向離心管中加入體積稍超過樣品的六甲基二硅胺。脫脂棉封住管口，置于60 ℃烘箱干燥直至樣品成粉末狀，送樣檢測[20]。

1.3.7Monacolin K合成相關基因的轉錄量測定

從2種發酵培養基中提取第2、5、8、12、15天的紅曲菌絲體，并將其貯存在液氮中保存。使用RNAprep純植物試劑盒從菌絲體中提取總RNA，并用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成第一鏈cDNA。利用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒進行RT-qPCR。根據NCBI網站的紅曲菌Monacolin K合成相關基因組序列，選取mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH、mokI(NCBI登錄號DQ176595.1)9段基因組以及內參基因GAPDH(NCBI登錄號HQ123044.1)進行分析，并由華大基因公司設計合成相應引物，特異性引物參照文獻[12]設計。熒光定量PCR反應條件為95 ℃反應15 min之后，以下過程進行40次循環：在95 ℃下變性10 s，在52 ℃下退火20 s，以及在72 ℃下延伸30 s。

用比較閾值周期法計算轉錄相對豐度，對每個樣品進行RT-qPCR，重復測量3次并取平均值。

1.4 數據處理

實驗均重復3次，數據利用 Excel 進行計算，采用Origin8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 Monacolin K產量分析

選取第5、8、12、15天的2種培養基中的菌液樣品，通過HPLC檢測Monacolin K產量，見圖1。由圖1可知，當添加煙酰胺為質量分數0.5%時，在Monacolin K大量生成的第8 天，實驗組較對照組降低28.51%左右，在之后的第12天，實驗組較對照組降低17.13%左右；實驗組在第15天時生成大量Monacolin K，并與對照組相比表現出優勢，Monacolin K產量較對照組提高了31.34%，達到124.23 mg/L。推測在對照組中添加煙酰胺后，可在發酵后期促進紫色紅曲菌M1大量生成Monacolin K。煙酰胺在生物體內的氧化還原反應中具有傳遞氫的作用，與糖酵解有密切關系，糖酵解過程是細胞需氧呼吸的第1步，三羧酸循環是細胞需氧呼吸的第2步[21]。Zhou等[22]通過向紅曲菌培養基中加入高氯化銨，對所有理論質譜進行連續窗口采集，并檢測蛋白質組圖譜的變化，開展生物信息學分析，實驗發現發酵過程中高氯化銨促進了糖酵解關鍵酶的活性，以及脂肪酸的β氧化，并產生了足夠的乙酰輔酶A。李穎慧等[20]發現在紅曲菌發酵液中添加質量分數0.1%的檸檬酸后，對 Monacolin K產量促進效果最為明顯，Monacolin K產量是原始培養基的2.71 倍。檸檬酸是三羧酸循環中的代謝物質，因此可以推測Monacolin K生成與糖酵解、三羧酸循環存在一定聯系，煙酰胺可能是通過利用糖酵解產生的乙酰輔酶A，從而大量促進Monacolin K生成 。

圖1 煙酰胺對Monacolin K產量的影響Fig.1 Effects of nicotinamide on yield of Monacolin K

2.2 紅曲色素色價測定結果

通過紫外- 可見分光光度計分別檢測第2、5、8、12、15天的2種培養基中紅曲紅色素、紅曲橙色素和紅曲黃色素，結果如圖2。3種色素的色價變化總體趨勢一致，均表現為先上升再下降的趨勢，在第12天時產量達到最高。通過對比實驗組和對照組發現，對照組菌株的3種色素產量均高于實驗組菌株。紅曲色素是紅曲菌在次級代謝過程中產生的一種由多種聚酮化合物組成的混合物。Juzlova等[23]認為紅曲色素通過聚酮途徑合成，且與 Monacolin K同屬聚酮類物質，兩者的合成途徑起始均由乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成丁酮后，再進入各自的代謝途徑，推斷二者存在一定的底物競爭關系。柴詩緣等[18]通過向培養基中添加谷氨酸，發現谷氨酸會增加Monacolin K的產量，但同時降低了紅曲色素的產量。相似的，李穎慧等[20]通過添加檸檬酸后，發現Monacolin K產量升高的同時，紅曲色素的產量降低。因此推測，紅曲菌中添加煙酰胺后，提高了Monacolin K產量的同時，在一定程度降低了紅曲色素的產量。

圖2 煙酰胺對紅曲色素產量的影響Fig.2 Effects of nicotinamide on pigment yield of Monascus

2.3 菌絲體生物量和pH值測定結果

通過比較實驗組和對照組菌株在不同階段的紅曲菌菌絲體干質量的差異，研究煙酰胺添加對紅曲菌菌絲體干重的影響，結果如圖3。在第5天生物量達到最高，5 d后呈現不同下降趨勢，實驗組菌株和對照組菌株菌絲體生物量變化趨勢基本一致，且差異并不明顯。

圖3 煙酰胺對菌絲體生物量的影響Fig.3 Effects of nicotinamide on biomass of mycelium

通過對pH值的檢測，研究煙酰胺添加對紅曲菌菌絲體培養基pH值的影響，結果如圖4。2種發酵培養基始終為弱酸性培養基，為紅曲菌提供了適宜的pH環境。在2～8 d，對照組培養基pH值均比實驗組培養基高，第8天后實驗組比對照組培養基pH值高。紅曲菌最適宜pH值為3.5～5.0[24]，推測在發酵初期，煙酰胺為發酵提供了較好的環境；隨著發酵的進行，紅曲菌將煙酰胺中NAD還原成NADH，利用了環境中的氫離子，因而pH值逐漸升高，8 d后實驗組pH值比對照組pH值略高，但仍低于6，隨后pH值趨于穩定。

圖4 煙酰胺對培養基pH值的影響Fig.4 Effects of nicotinamide on pH value of media

2.4 菌絲體超微結構觀察結果

通過掃描電鏡檢測實驗組和對照組菌株菌絲體的形態差異，結果如圖5。對比圖5(a)和圖5(b)可知，實驗組菌株的孢子頭與對照組菌株相比，褶皺、凹陷更多，且菌體更加膨大；對比圖5(c)和圖5(d)可知，實驗組菌株的菌絲體褶皺程度明顯多于對照組菌株，表面積更大。因此推測，煙酰胺的添加可能通過改變菌絲體形態，使細胞壁與原生質體之間縫隙增加，細胞膜通透性增大[25]，從而使得胞內積累的Monacolin K轉移至胞外，提高發酵液中Monacolin K產量。Zhang等[12]通過向紅曲菌培養基中添加谷氨酸，最終發現，實驗組較對照組菌絲形態表現出更多的褶皺和更大的凹陷，表明菌絲體的通透性可能增強。Lv等[3]研究表明：菌絲直徑與紅曲黃色素的生物合成高度相關，這些菌體形態的改變在一定程度上可以影響次級代謝產物的產量。因此本研究推測，添加煙酰胺后，通過菌體形態發生改變，進而影響了Monacolin K產量。

圖5 煙酰胺對菌絲體形態的影響Fig.5 Effect of nicotinamide on morphology of mycelium

2.5 Monacolin K合成相關基因的轉錄量分析

通過熒光定量PCR技術檢測煙酰胺添加對紅曲菌Monacolin K合成相關基因表達量的影響，結果如表1。煙酰胺添加后，在第12天時實驗組菌株與對照組菌株相比，mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG和mokH基因的表達量呈現上調現象,其中mokA、mokB、mokE、mokH表達量顯著上調，而mokI基因表達量呈現下調現象。

表1 mokA～mokI基因的轉錄量分析Tab.1 Transcriptional analysis of mokA-mokI genes

Chen等[26]在叢毛紅曲菌(M.pilosus)中發現了與土曲霉中Monacolin K合成酶基因簇具有高度同源性的9段基因，命名為mokA～mokI，推測該9段基因為Monacolin K合成酶基因簇，mokA和mokB主要參與聚酮合酶的合成[26]。薛意斌等[27]研究發現：通過在紅曲菌培養基中添加甘油，隨著甘油濃度的增加，mokB的表達量先升高后降低，當甘油濃度為8%時，mokB的表達量較對照組增加32%，mokB的高表達促進了Monacolin K的積累。Zhang等[28]通過將mokE在紫色紅曲菌 M1中進行過表達，最終導致Monacolin K的產生增加89.5%，大大提高了Monacolin K的產量。mokH基因推測其是一種轉錄因子，Chen等[29]在毛霉中過表達mokH基因，發現mokH轉化株中Monacolin K產量是野生型菌株的1.7倍，通過RT-qPCR分析發現，mokH轉化子中Monacolin K合成基因的表達高于野生型菌株，這表明mokH對Monacolin K的產生具有積極的調節作用。mokG基因編碼HMG-CoA(3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A)還原酶[30]，而HMG-CoA還原酶對Monacolin K合成有很強的抑制作用。而在本實驗中mokG基因表達量呈現上調現象，因此對于基因間的相互作用有待進一步研究。最終轉錄量結果顯示：通過對mokA、mokB、mokE、mokH基因表達量的顯著上調以及mokI基因表達量的下調，影響了Monacolin K的合成途徑。推測，煙酰胺通過影響與紅曲菌Monacolin K合成相關基因的轉錄量水平，進而影響Monacolin K的產量。

3 結 論

研究通過添加質量分數0.5%的煙酰胺，與對照組中的M1菌株對比，分析煙酰胺對紅曲色素色價、Monacolin K產量、菌體形態，以及與紅曲菌Monacolin K合成相關基因的轉錄量水平的影響。研究發現：在對照組中添加適量質量分數的煙酰胺，使Monacolin K的產量提高了31.34%，達到124.23 mg/L。但同時對紅曲色素產量有一定程度的抑制作用；煙酰胺對菌絲體生物量與培養基pH值無顯著影響。通過掃描電鏡對菌絲體進行超微結構觀察發現：煙酰胺可能提高了紅曲菌菌絲體通透性，加速了Monacolin K分泌到細胞外的過程，細胞質中的Monacolin K含量降低，進而達到Monacolin K積累量增加的效果。通過RT-qPCR對紅曲菌Monacolin K合成相關基因的轉錄量進行測定，發現添加煙酰胺后，mokA～mokH的表達量不同程度上調，但同時mokI的表達量下調，煙酰胺可能是通過調節Monacolin K合成的某些關鍵基因，進而調控Monacolin K的產量。本研究通過添加外源物質研究影響紅曲菌次級代謝產物Monacolin K 產量的因素，以期為進一步探究高產Monacolin K的方法提供理論依據。